邢天嬌 李東霞 張娟 賈敏鑫

1內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院皮膚科，呼和浩特010050；2昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科650045

小檗堿是一種異喹啉類季銨生物堿，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有一定的抑制和殺傷作用，且毒性低、不良反應(yīng)少，可用于治療多種癌癥［1?2］。本課題組前期體外實(shí)驗(yàn)［3］已證實(shí)，小檗堿具有抑制皮膚鱗狀細(xì)胞癌（cutaneous squamous cellcarcinoma，cSCC）細(xì)胞系A(chǔ)431增殖，促進(jìn)其凋亡，抑制其遷移的作用。在此基礎(chǔ)上，我們建立cSCC?A431 裸鼠移植瘤模型，研究小檗堿對(duì)cSCC裸鼠移植瘤A431細(xì)胞增殖、凋亡的作用，探討其抗腫瘤作用，為cSCC 治療提供新線索。

材料與方法

一、細(xì)胞株及主要試劑和儀器

BALB/c?Foxn1nu雌性裸鼠20 只由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)為201808257；本實(shí)驗(yàn)在南京米度生物技術(shù)有限公司完成，動(dòng)物使用許可證號(hào)為SYXK（蘇）2020?0016。A431 細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫（目錄號(hào)為TCHu188）。小檗堿粉末（美國Sigma?Aldrich公司）溶于蒸餾水，配成濃度為1 g/L。Tunnel 試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，貨號(hào)KGA704），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本TaKaRa 公司，貨號(hào)RR047A），Ki67 免疫組化試劑盒（丹麥Dako 公司，貨號(hào)K4003）。RPMI 1640 培養(yǎng)基，ECL 化學(xué)發(fā)光液（美國ThermoFisher 公司）；兔抗Bcl?2 抗體（美國Proteintech Group公司，貨號(hào)12789?1?AP）；兔抗Bax抗體、兔抗胱天蛋白酶（caspase）?3 抗體、鼠抗埃茲蛋白（Ezrin）抗體、兔抗Ki67 抗體（英國Abcam 公司，貨號(hào)分別為ab32503、ab44976、ab4069、ab16667）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記抗兔抗體、HRP抗小鼠抗體（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)分別為A0208、A0216）。StepOne Plus 定量PCR 儀（美國Applied Biosystems公司），Tanon5200化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.A431 細(xì)胞培養(yǎng)：A431 細(xì)胞于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d，胰酶終消化后離心。1個(gè)培養(yǎng)皿細(xì)胞消化后，接種至3 個(gè)培養(yǎng)皿中進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。A431 細(xì)胞生長至80% ～90%時(shí)胰酶消化、離心，棄上清液，加培養(yǎng)基重懸后進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)。胰酶消化，加磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸，計(jì)數(shù)細(xì)胞，將密度調(diào)整至5×107個(gè)/ml。

2. cSCC?A431 裸鼠移植瘤模型的建立和分組處理：20只8周齡雌性裸鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，自由攝食，室溫26 ℃～28 ℃，相對(duì)濕度40%～50%。飼養(yǎng)7 d后，于每只裸鼠右背部皮下緩慢注射5×107個(gè)/ml細(xì)胞懸液100 μl，建立cSCC?A431 裸鼠移植瘤模型。接種第15天，腫瘤直徑約4 mm，將裸鼠隨機(jī)分為小檗堿低、中、高劑量組和對(duì)照組，每組5只，低、中、高劑量組分別于腹腔注射10、20、25 mg/kg小檗堿溶液，對(duì)照組注射等量生理氯化鈉溶液，每日1 次，連續(xù)給藥35 d，藥物劑量的確定參考預(yù)實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)［4］。分別于給藥前、給藥第7、14、21、28、35 d，采用LINKS 哈量電子游標(biāo)卡尺測量腫瘤的最長徑（a，cm）與最短徑（b，cm），腫瘤體積（V，cm3）= a ×b2/2，并繪制體積變化曲線。35 d 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死裸鼠，取材，拍照后凍存。

3.標(biāo)本收集：處死裸鼠后隨即手術(shù)剝離瘤塊稱重，腫瘤生長抑制率=［（對(duì)照組平均瘤重－治療組平均瘤重）/對(duì)照組平均瘤重］×100%。

4.瘤體組織病理檢查：4%甲醛溶液固定剝離的瘤體組織，制成石蠟切片，HE染色，光鏡觀察。

5.免疫組化檢測小檗堿作用后移植瘤組織中Ki67 蛋白的表達(dá)：各組石蠟切片常規(guī)脫蠟脫水，PBS 沖洗3 次，置EDTA 緩沖液中微波修復(fù)，PBS 沖洗5 min 3 次；3%過氧化氫甲醇溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10 min；PBS沖洗5 min 3次，甩干后5%牛血清白蛋白（BSA）封閉20 min；棄BSA 液，滴加50 μl 稀釋的兔抗Ki67 抗體，4 ℃下過夜，PBS 沖洗5 min 3 次。去除PBS 液，滴加50 ～100 μl 抗兔二抗，4 ℃孵育過夜，PBS沖洗5 min 3次；二氨基聯(lián)苯胺（DAB）溶液顯色，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水封片。光鏡觀察，染色為棕色細(xì)胞代表Ki67陽性，分別計(jì)數(shù)3 個(gè)200 倍視野Ki67 陽性細(xì)胞數(shù)并計(jì)算平均數(shù)，采用雙盲法判定計(jì)數(shù)，2 位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師反復(fù)核對(duì)。

6.TUNNEL染色檢測移植瘤組織中細(xì)胞凋亡：石蠟切片脫蠟至水，依次加入二甲苯Ⅰ15 min、二甲苯Ⅱ15 min、濃度梯度100%、85%、75%乙醇3 min，蒸餾水洗；接著加入蛋白酶K工作液在室溫下孵育30 min，PBS 洗片3 次，每次5 min；滴加TUNNEL 試劑盒內(nèi)適量試劑1 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）和試劑2 脫氧尿苷三磷酸（dUTP）按2∶29混合，37 ℃濕盒孵育2 h；PBS沖洗5 min 3次；滴加3%過氧化氫甲醇溶液，室溫避光孵育15 min；甩干切片，滴加適量熒光素抗體converter?POD，37 ℃溫箱孵育30 min，PBS 沖洗5 min 3 次；甩干后滴DAB顯色液，自來水沖洗切片終止顯色；蘇木素復(fù)染3 min，自來水沖洗，1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，自來水沖洗，氨水返藍(lán)，流水沖洗；最后用梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。顯微鏡下拍照，采用上述免疫組化方法計(jì)數(shù)，棕黃色細(xì)胞核代表凋亡細(xì)胞，分別計(jì)數(shù)3 個(gè)200 倍視野凋亡細(xì)胞數(shù)并計(jì)算平均數(shù)。

7.熒光定量PCR 檢測cSCC?A431 裸鼠移植瘤中Bax、Bcl?2、caspase?3、Ezrin mRNA 相對(duì)表達(dá)量：采用Trizol 法提取移植瘤組織總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，引物序列見表1。按熒光定量PCR試劑盒說明書配制溶液，反應(yīng)體系為cDNA 2.0 μl、正反向引物各0.4 μl、SYBR Green solution 10.0 μl、滅菌雙蒸水7.2 μl，總量為20 μl；預(yù)變性95 ℃10 min；變性95 ℃5 s、退火、延伸60 ℃1 min，共40 個(gè)循環(huán)。采集數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，△Ct = Ct目的基因－Ct內(nèi)參基因，△△Ct = △Ct小檗堿組－△Ct對(duì)照組，以2-△△Ct計(jì)算各基因mRNA相對(duì)表達(dá)。

8.Western 印跡法測定cSCC?A431裸鼠移植瘤中Bax、Bcl?2、caspase?3、Ezrin 蛋白的表達(dá)量：液氮研磨各組腫瘤組織，冰上裂解，提取組織中總蛋白，用二喹啉甲酸（BCA）試劑盒進(jìn)行蛋白定量。30 mg蛋白溶液中加入5×SDS 上樣緩沖液，至沸水中煮5 min，加足量電泳液，于濃縮膠中60 V 電泳30 min，樣品進(jìn)入分離膠后，改用80 V電泳90 min。電泳至溴酚藍(lán)剛跑出即可終止電泳，然后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；采用含5% BSA 的TBST 溶液按1∶1 000 稀釋Bax、Bcl?2、caspase?3、Ezrin 一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜10 min 3次；加1∶5 000 TBST溶液稀釋的二抗（HRP 抗小鼠抗體、HRP 抗兔抗體）室溫孵育2 h；TBST洗膜3次后，ECL化學(xué)發(fā)光，Tanon凝膠成像儀拍照，各蛋白的相對(duì)表達(dá)量為各蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值的比值。

基因名稱Bax Bcl?2胱天蛋白酶3埃滋蛋白甘油醛-3-磷酸脫氫酶正向引物（5′→3′）序列GGATGCGTCCACCAAGAA GAACATTTCGGTGACTTCCG GACTGGAAAGCCGAAACTCT AGAGACGGTGGAGAGAGAAA GTGGCAAAGTGGAGATTGTTG Tm（℃）54.7 54.2 54.8 54.4 54.9反向引物（5′→3′）序列CATCCTCTGCAGCTCCATATT CCTGTTGATCATCCCTGGAG GTATCTTCTGGCAAGCCATCT CTTGGTCTTCTGCTCGTAGTC CGTTGAATTTGCCGTGAGTG Tm（℃）54.4 54.3 54.6 55.0 55.4

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果

一、小檗堿抑制cSCC?A431裸鼠移植瘤的生長

4 組cSCC 裸鼠腫瘤生長曲線見圖1。隨小檗堿劑量升高和作用時(shí)間延長，腫瘤生長曲線逐漸變平緩。與對(duì)照組相比，各小檗堿組腫瘤生長受到不同程度的抑制，其中高劑量組腫瘤生長抑制作用最明顯。用藥第35 天，低、中、高劑量組瘤體積顯著低于對(duì)照組（t = 3.08、6.81、7.38，均P < 0.01），見表2。4 組移植瘤重量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.01），且各小檗堿組瘤重均顯著低于對(duì)照組（t =4.07、6.33、7.26，均P<0.01）。見圖2、表2。小檗堿低、中、高劑量組腫瘤生長抑制率分別為31.05%、66.68%、76.49%。

二、不同劑量小檗堿處理后cSCC?A431裸鼠移植瘤的組織病理表現(xiàn)

對(duì)照組cSCC?A431 裸鼠移植瘤組織見大量鱗狀細(xì)胞腫瘤團(tuán)塊，細(xì)胞異形性明顯，可見核分裂相及瘤巨細(xì)胞，細(xì)胞間橋消失，腫瘤細(xì)胞無壞死或少量點(diǎn)狀壞死（圖3）；小檗堿低劑量組腫瘤細(xì)胞團(tuán)間壞死灶較分散，呈點(diǎn)狀分布，中劑量組腫瘤細(xì)胞團(tuán)之間可見灶性壞死區(qū)域，高劑量組腫瘤細(xì)胞團(tuán)之間出現(xiàn)大片狀壞死（圖3）。高劑量組腫瘤壞死的范圍、程度最大。

三、免疫組化法檢測不同劑量小檗堿處理后cSCC?A431裸鼠移植瘤中Ki67蛋白的表達(dá)

瘤體積（mm3）697.48±107.49 480.91±139.57a 218.80±116.45a 179.11±69.14a 23.84<0.01瘤重（g）0.55±0.15 0.31±0.06a 0.18±0.07a 0.13±0.05a 20.91<0.01 Ki67陽性細(xì)胞數(shù)（200倍視野）93.33±7.09 67.33±5.69a 34.33±7.02a 23.00±5.29a 76.79<0.01組別對(duì)照組小檗堿低劑量組小檗堿中劑量組小檗堿高劑量組F值P值凋亡細(xì)胞數(shù)（200倍視野）17.33±4.73 27.67±3.79b 39.00±3.00a 41.67±3.06a 27.27<0.01

對(duì)照組可見大量表達(dá)Ki67 的棕色A431 細(xì)胞，而加入小檗堿處理后，隨劑量增加，Ki67 陽性細(xì)胞減少。見圖4。小檗堿低、中、高劑量組Ki67 陽性細(xì)胞數(shù)均顯著低于對(duì)照組（t=5.03、11.43、13.62，均P<0.01），見表2。

四、TUNNEL 法檢測小檗堿處理后cSCC?A431裸鼠移植瘤中細(xì)胞凋亡

對(duì)照組瘤組織中棕黃色陽性細(xì)胞少，染色淺；而加入小檗堿處理后，隨其劑量增加，凋亡細(xì)胞逐漸增多，染色深。見圖5。小檗堿低、中、高劑量組凋亡細(xì)胞數(shù)均顯著高于對(duì)照組（t=3.41、7.16、8.04，P<0.05或<0.01），見表2。

五、熒光定量PCR檢測小檗堿對(duì)cSCC?A431裸鼠移植瘤中Bax、Bcl?2、caspase?3、Ezrin mRNA表達(dá)的影響

組別mRNA相對(duì)表達(dá)（2-△△Ct）Bax 1.00±0.00 1.25±0.36 1.66±0.40 2.38±0.33a 10.96<0.01 Bcl?2 1.00±0.00 0.74±0.05a 0.50±0.01a 0.36±0.06a 146.39<0.01 caspase?3 1.00±0.00 1.35±0.07 2.01±0.19b 2.86±0.72a 14.12<0.01 Ezrin 1.00±0.00 1.20±0.32 1.46±0.24 2.33±0.07a 25.01<0.01對(duì)照組小檗堿低劑量組小檗堿中劑量組小檗堿高劑量組F值P值蛋白相對(duì)表達(dá)（以GAPDH為內(nèi)參）Bax 0.33±0.06 0.59±0.06a 0.93±0.09a 1.01±0.06a 59.60<0.01 Bcl?2 1.02±0.03 0.90±0.03 0.64±0.08a 0.42±0.12a 34.81<0.01 caspase?3 0.29±0.05 0.61±0.07a 0.93±0.07a 0.98±0.09a 59.02<0.01 Ezrin 1.02±0.07 0.76±0.06a 0.55±0.03a 0.39±0.05a 74.58<0.01

4 組Bax、Bcl?2、caspase?3、Ezrin mRNA 的表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.01）。見表3。其中，小檗堿高劑量組Bax和Ezrin mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組（t=5.36、8.02，均P<0.01），而小檗堿低、中劑量組與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）。小檗堿中、高劑量組caspase?3 mRNA的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組（t = 3.30、6.04，P < 0.05或<0.01），而小檗堿低劑量組與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。此外，小檗堿低、中、高劑量組Bcl?2 mRNA 的表達(dá)均顯著低于對(duì)照組（t = 7.76、15.20、19.43，均P<0.01）。

六、Western 印跡法測定不同劑量小檗堿處理后cSCC?A431 裸鼠移植瘤組織中Bax、Bcl?2、caspase?3、Ezrin蛋白的表達(dá)

隨小檗堿劑量的增加，Bax、caspase?3蛋白表達(dá)逐漸增加，而Bcl?2 蛋白、Ezrin 蛋白表達(dá)逐漸降低。見圖6、表3。小檗堿低、中、高劑量組Bax、caspase?3 蛋白表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組（Bax：t =4.37、10.32、11.80；caspase?3：t=5.41、10.87、11.69；均P<0.01），而Ezrin 蛋白的表達(dá)均顯著低于對(duì)照組（t = 5.88、10.67、14.06，均P < 0.01）；小檗堿中、高劑量組Bcl?2 蛋白的表達(dá)均顯著低于對(duì)照組（t=5.86、9.34，均P<0.01），而小檗堿低劑量組與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

討論

近年小檗堿的抗腫瘤作用在多種腫瘤研究中獲較大突破。本研究采用cSCC A431 細(xì)胞裸鼠移植瘤模型探究小檗堿抗cSCC 機(jī)制。與對(duì)照組相比，10、20、25 mg/kg 小檗堿對(duì)cSCC?A431 移植瘤生長均有不同程度的抑制作用，隨小檗堿劑量的增加，移植瘤生長逐漸變緩，腫瘤生長抑制率增高。組織病理檢查顯示，隨小檗堿劑量的增加，腫瘤細(xì)胞壞死逐漸增多，高劑量組腫瘤細(xì)胞壞死面積更廣泛。Ki67與細(xì)胞有絲分裂相關(guān)，在增殖活躍的腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，因此常作為多種腫瘤細(xì)胞增殖的標(biāo)志物［5］。免疫組化顯示，隨小檗堿劑量的增加，Ki67表達(dá)逐漸降低，提示小檗堿可抑制cSCC?A431移植瘤細(xì)胞增殖。TUNNEL實(shí)驗(yàn)顯示，低、中、高劑量小檗堿均能促進(jìn)cSCC?A431 移植瘤細(xì)胞凋亡。本文結(jié)果與前期小檗堿對(duì)A431 體外研究結(jié)果相符［3］。

惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與諸多因素相關(guān)，細(xì)胞凋亡能力的異常降低與增殖能力的異常增強(qiáng)是其關(guān)鍵因素之一，而小檗堿與多種惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡與增殖有關(guān)［6］。Bcl?2 和Bax 是細(xì)胞凋亡研究中最受重視的2 個(gè)癌基因，其中大多數(shù)Bcl?2 家族蛋白位于哺乳動(dòng)物的線粒體外膜上，可通過調(diào)節(jié)線粒體通透性來調(diào)控細(xì)胞凋亡［7］。Bax 作為Bcl?2 家族成員之一，其生理作用與Bcl?2相反，表現(xiàn)為促進(jìn)細(xì)胞凋亡［8］。caspase 是細(xì)胞程序性死亡信號(hào)網(wǎng)的重要部分，細(xì)胞凋亡過程中caspase?3 的激活受上游Bcl?2因子調(diào)控，而小檗堿可誘導(dǎo)Bcl?2家族成員活化，導(dǎo)致線粒體膜電位及通透性改變，促使相關(guān)蛋白酶活化，使線粒體釋放細(xì)胞色素C 等，導(dǎo)致caspase 級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活，尤其激活反應(yīng)關(guān)鍵酶caspase?3，從而引發(fā)凋亡［9?10］。本研究顯示，低、中、高劑量小檗堿處理后cSCC?A431 裸鼠移植瘤中凋亡相關(guān)蛋白Bax、caspase?3 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)有不同程度的增加，而Bcl?2 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)有不同程度的降低，其中小檗堿高劑量組Bax、caspase?3、Bcl?2 mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)與對(duì)照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Ezrin 蛋白具有參與細(xì)胞膜的連接，維持細(xì)胞形態(tài)，調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等，且與腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［11］。Ezrin蛋白作為連接細(xì)胞膜與細(xì)胞骨架的重要分子，通過相應(yīng)氨基酸載體與Fas 結(jié)合［12］，使Ezrin 蛋白從細(xì)胞膜易位到細(xì)胞質(zhì)中，同時(shí)伴隨Ezrin蛋白的去磷酸化［13］，導(dǎo)致Ezrin蛋白失活，最終誘發(fā)凋亡［14］。本研究中，小檗堿高劑量組Ezrin mRNA相對(duì)表達(dá)顯著高于對(duì)照組，而低、中、高劑量組Ezrin蛋白表達(dá)卻顯著低于對(duì)照組。Ezrin mRNA表達(dá)結(jié)果與預(yù)期不同，且與其蛋白表達(dá)結(jié)果不一致，分析其原因：①mRNA 轉(zhuǎn)錄、加工、翻譯形成蛋白過程復(fù)雜，中間微小環(huán)節(jié)偏差均可導(dǎo)致結(jié)果不同；②轉(zhuǎn)錄與翻譯存在時(shí)間間隔，檢測時(shí)間點(diǎn)不同，轉(zhuǎn)錄水平與翻譯水平可能存在差異；③mRNA是單鏈結(jié)構(gòu)，相對(duì)不穩(wěn)定，且熒光定量PCR靈敏度高，應(yīng)進(jìn)一步增加實(shí)驗(yàn)次數(shù)以排除實(shí)驗(yàn)誤差。

綜上所述，小檗堿通過抑制cSCC?A431移植瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而有效抑制cSCC?A431移植瘤生長，其機(jī)制可能與小檗堿下調(diào)Bcl?2、Ezrin表達(dá)，同時(shí)上調(diào)Bax、caspase?3的表達(dá)有關(guān)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突