鄭 鳴，郭宏偉，李華瑋，趙緒永，王老七，魏露露，王永芬

(河南牧業(yè)經(jīng)濟學院食品與生物工程學院，河南 鄭州 450046)

雞心包積液綜合征(Hydropericardium syndrome，HPS)是由禽腺病毒I群血清4型引起的高度傳染性疾病。1987年，該病首次發(fā)現(xiàn)于巴基斯坦安卡拉(Angara)地區(qū)，俗稱安卡拉病(Angara disease)，隨后在印度、加拿大、美國、韓國和日本等多個國家暴發(fā)流行[1-2]，自2015年開始，我國山東、山西、河南、河北、遼寧等地先后有心包積液綜合征疫情報道[3-4]，且呈逐年增強趨勢。雞心包積液綜合征主要發(fā)生在 20～30日齡肉雞中，可引起心包積水、嚴重肝炎，發(fā)病急，死亡率高；還可引起免疫抑制，造成疫苗免疫失敗，繼發(fā)新城疫、傳染性法氏囊病、大腸桿菌病等疫病[5-6]，加劇病情發(fā)展，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。

禽腺病毒(Fowl adenovirus，F(xiàn)AdV)是無囊膜線性雙鏈DNA病毒，屬于腺病毒科(Adenoviridae)，是禽類常見的傳染性病原之一[7]。根據(jù)血清型不同可分為I、II、III亞群，其中I群禽腺病毒包括12個血清型，具有共同的群抗原[8]，大多數(shù)I群腺病毒對禽類的致病作用尚未確定，而研究者普遍認為血清4型腺病毒(FAdV-4)是引起雞心包積液綜合征的主要病原[9-10]。資料顯示，F(xiàn)AdV-4在中國的雞群中感染率很高，且多為隱性感染，一旦發(fā)生應(yīng)激或感染其他疾病，即可引起呼吸道疾病、生長遲緩、產(chǎn)蛋下降等癥狀[11-12]，危害嚴重，建立一種快速、準確的病原學檢測方法就顯得尤為重要。

目前，針對FAdV-4的實驗室檢測方法主要有病毒分離、免疫吸附試驗(ELISA)、膠體金紙條、熒光定量RT-PCR和環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)等[13-14]。病毒分離準確度高，但操作復(fù)雜，診斷時間長，不適合快速診斷；基于抗原抗體反應(yīng)的免疫學診斷技術(shù)，操作簡單，檢測時間短，但因病原血清型眾多、抗原變異快，檢測準確度和靈敏度低，重復(fù)性不好；基于核酸擴增的分子診斷技術(shù)，直接針對核酸檢測，特異性強，準確度高，但由于檢測易污染且對核酸完整性要求高而導(dǎo)致檢測結(jié)果不理想，限制了分子診斷技術(shù)的推廣應(yīng)用。六鄰體(Hexon)是FAdV-4衣殼蛋白，與致病性密切相關(guān)，包含主要種屬特異性抗原決定簇，是中和抗體重要靶標，六鄰體(hexon)基因也是FAdV-4的分子診斷主要靶基因[15]。本試驗根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫中FAdV-4的hexon基因序列保守性及分子進化特點，設(shè)計特異性雙探針，通過雜交、單鏈置換和PCR擴增，建立FAdV-4環(huán)介導(dǎo)PCR檢測技術(shù)，旨在為雞心包積液綜合征的病原學診斷和流行病學調(diào)查提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、毒株及病料 TRIzol試劑，購自美國Invitrogen公司；耐熱連接酶，購自英國NEB公司；高保真酶Pfu和DL-2 000，均購自寶生物工程(大連)有限公司。試驗所用活疫苗NDV、IBV、CIAV、IBDV、FPV，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；MDV，購自南京梅里亞動物保健品公司；H9N2亞型AIV、FAdV-4和FAdV-11尿囊液由本實驗室鑒定保存；質(zhì)粒pMD18-T-Lectin由本實驗室構(gòu)建保存。試驗用103份雞的肝臟、脾臟、腎臟等病料由河南牧業(yè)經(jīng)濟學院禽病研究所收集自鄭州市周邊縣市養(yǎng)雞場，-80 ℃ 凍存。

1.2 雙探針設(shè)計及引物合成 以GenBank 收錄的FAdV-4六鄰體hexon基因(KU877432.1)為參考，采用MegAlign軟件分析hexon基因的保守性及進化特征，選取2段長度為10～20 bp、序列相鄰的保守區(qū)作為雜交雙探針，Blastn在線分析特異性。試驗中用到的雙探針、標記引物和檢測引物序列見表1，利用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計，由寶生物工程(大連)有限公司合成。

表1 雙探針、標記引物和檢測引物序列及特性Table 1 The sequences and properties of labeling primers，detection primer and dual-probe

1.3 核酸的分離 DNA制備：病毒DNA、病料基因組DNA分離按參考文獻[23]進行。RNA制備：病毒RNA、病料總RNA則采用TRIzol試劑方法，具體操作按照說明書進行。分離的核酸樣品于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 雙探針標記報告基因 以重組質(zhì)粒pMD18-T-Lectin為模板，以F-1、R-1為引物對，采用PCR擴增大豆Lectin基因片段，制備雙探針標記的報告基因，50 μL PCR反應(yīng)體系包括：5×Pfu Buffer 5 μL，dNTP(2.5 mmol/L) 4 μL，F(xiàn)-1和R-1(10 μmol/L)各1 μL， 重組質(zhì)粒pMD18-T-Lectin 0.5 μL，高保真Pfu(5U/μL) 0.25 μL，加ddH2O補足50 μL；反應(yīng)條件依次為：預(yù)變性5 min后，進行循環(huán)94 ℃ 30 s→ 60 ℃ 30 s→72 ℃ 30 s，擴增35個循環(huán)。2%凝膠電泳檢測，膠回收產(chǎn)物，獲得FAdV-4雙探針標記的報告基因，保存-20 ℃冰箱備用。

1.5 環(huán)介導(dǎo)PCR檢測方法建立 根據(jù)試驗設(shè)計，采用一步法進行環(huán)介導(dǎo)PCR檢測試驗，即在同一反應(yīng)管中依次進行雙探針雜交識別目的基因、單鏈置換和反向PCR擴增，50 μL反應(yīng)體系包含：10×Pfu Buffer 5 μL，10×Ligase Buffer 5 μL，高保真Pfu(5U/μL) 0.5 μL，耐熱連接酶 0.5 μL，dNTPs(各10 mmol/L) 1～2 μL，報告基因各1～3 μL，檢測引物 F-2和R-2(10 μmol/L)各0.5～1 μl，病毒核酸2 μL。 循環(huán)條件依次為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s →50～60 ℃ 3 min，10個循環(huán)；95 ℃ 50 s→50～60 ℃ 50 s→72 ℃ 50 s，25個循環(huán)。產(chǎn)物經(jīng)2%凝膠電泳檢測與克隆測序驗證，測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.6 特異性試驗 分別以FAdV-4、FAdV-11、NDV、CIAV、IBDV、IBV和MDV的核酸樣品為模板，采用方法1.5中反應(yīng)體系及循環(huán)條件分別進行環(huán)介導(dǎo)PCR擴增，3%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增情況，評估方法的特異性。

1.7 靈敏度試驗 用NanoDrop超微量分光光度計對 FAdV-4核酸樣品進行濃度及純度分析，并用無菌ddH2O調(diào)整核酸濃度至1.0 ng/μL，再進行2倍倍比稀釋，依次形成核酸濃度(pg/μL)為500、250、125、62.5、31.3、15.7、7.85 和3.93共8個梯度樣品，分別進行環(huán)介導(dǎo)PCR擴增，觀察電泳結(jié)果，確定檢測的最低核酸濃度。

1.8 臨床樣品比較檢測 采用方法1.3抽提103份供試臨床病料基因組DNA，分別進行常規(guī)PCR、環(huán)介導(dǎo)PCR和SYBR Green PCR檢測FAdV-4病原，觀察檢測結(jié)果，計算3種方法對FAdV-4的陽性檢出率；同時利用統(tǒng)計分析軟件SPSS13.0進行Kappa檢驗，比較分析環(huán)介導(dǎo)PCR和實時PCR檢測的敏感性、特異性和一致性。

2 結(jié)果

2.1 雙探針標記報告基因的制備 以F-1和R-1為引物，采用常規(guī)PCR擴增質(zhì)粒pMD18-T-Lectin，獲得特異性雙探針標記的報告基因Lectin，電泳檢測發(fā)現(xiàn)在Marker 250～500 bp之間有1條清晰條帶，擴增片段大小與392 bp的預(yù)期片段相一致(圖1)。

圖1 Hexon 雙探針標記報告基因制備Fig.1 Preparation of reporter genes labeled with dual- probes for Hexon geneM:DNA分子量標記DL-2 000； 1:陰性對照；2:Hexon雙探針標記的報告基因M:DNA Marker DL-2 000; 1:Negative control;2:Reporter gene labeled with dual-probes for Hexon gene

2.2 環(huán)介導(dǎo)PCR檢測FAdV-4 根據(jù)試驗原理以及探針、報告基因和檢測引物的設(shè)計情況，環(huán)介導(dǎo)PCR擴增FAdV-4基因產(chǎn)物大小應(yīng)為362 bp。電泳結(jié)果(圖2)顯示，F(xiàn)AdV-4樣品有1條清晰的特異性擴增條帶，條帶位置在Marker 250～500 bp，與預(yù)期大小一致，而陰性對照樣品則未見明顯擴增；膠回收上述特異性條帶，經(jīng)T/A克隆和測序分析，結(jié)果顯示，上述擴增片段中包含一段40 bp FAdV-4Hexon基因片段，兩側(cè)則為大豆Lectin基因片段，與設(shè)想完全符合。

圖2 環(huán)介導(dǎo)PCR檢測FAdV-4結(jié)果Fig.2 The result of detecting FAV-4 by loop-mediated PCRM:DNA分子量標記DL-2 000； 1:陰性對照；2:FAdV-4M:DNA Marker DL-2 000; 1:Negative control; 2:FAV-4

2.3 特異性試驗 采用方法1.5，按優(yōu)化后的循環(huán)體系及條件分別對FAdV-4、FAdV-11、NDV、IBDV、CIAV、IBV和MDV等樣品進行環(huán)介導(dǎo)PCR擴增，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅有FAdV-4樣品可見特異性擴增條帶，而其他病毒核酸樣品和陰性對照樣品未見明顯擴增(圖3)，表明該檢測方法特異性好，且與其他病原無交叉反應(yīng)，可有效檢測FAdV-4病毒。

2.4 靈敏度試驗 靈敏度試驗結(jié)果(圖4)表明，經(jīng)倍比稀釋后的FAdV-4核酸樣品中，有7個濃度的核酸樣品可見特異性擴增，條帶亮度隨核酸濃度的降低而逐漸減弱，當核酸濃度低至3.93 pg/μL時則無法觀察明顯條帶。結(jié)果表明，所建立的FAdV-4環(huán)介導(dǎo)PCR檢測方法靈敏度高，可檢測的最低極限核酸濃度為7.85 pg/μL。

圖3 特異性試驗Fig.3 The results of specificity assayM:DNA分子量標準DL-2 000； 1～8：陰性對照、FAdV-4、FAdV-11、NDV、IBDV、CIAV、IBV和MDVM:DNA Marker DL-2 000; 1～8:Negative control,FAdV-4,FAdV-11,NDV,IBDV,CIAV,IBV,MDV

圖4 靈敏度試驗Fig.4 The results of sensitivity assayM:DNA分子量標記DL-2 000； 1：陰性對照； 2～9：FAdV-4核酸濃度(pg/μL)分別為500、250、125、62.5、31.3、15.7、7.85和3.93M:DNA Marker DL-2 000; 1:Negative control；2～9:Concentration of nucleic acids (pg/μL) of FAV-4 was 500,250,125,62.5,31.3,15.7,7.85 and 3.93,respectively

2.5 臨床樣品比較檢測 利用常規(guī)PCR、環(huán)介導(dǎo)PCR和實時PCR 3種方法分別對103份疑似病料DNA進行了比較檢測。結(jié)果如表2所示，在103份病料DNA中，常規(guī)PCR、環(huán)介導(dǎo)PCR和實時PCR分別檢出陽性33份、36份、37份，陽性檢出率分別為32.0%，35.0%和35.9%；環(huán)介導(dǎo)PCR對FAdV-4的陽性檢出率接近定量PCR，而高于常規(guī)PCR。采用Kappa值法分析環(huán)介導(dǎo)PCR和SYBR Green 實時PCR對103份疑似樣品檢測結(jié)果的一致性，結(jié)果如表3所示,環(huán)介導(dǎo)PCR對FAdV-4檢測的敏感度、特異度和準確度分別為97.30%、100%和99.03%，Kappa值為κ=0.98,表明環(huán)介導(dǎo)PCR對FAdV-4檢測的敏感度、特異度、準確度與SYBR Green 實時PCR相當，2種方法檢測結(jié)果高度一致。

表2 常規(guī)PCR、環(huán)介導(dǎo)PCR和SYBR Green實時PCR對臨床樣本FAdV-4檢出率比較Table 2 Comparison of the detection of FAV-4 infected clinical samples by conventional PCR,loop-mediated PCR and SYBR Green real-time PCR assays

表3 環(huán)介導(dǎo)PCR和SYBR Green 實時PCR對臨床樣本檢測的敏感性、特異性分析Table 3 Sensitivity and specificity of loop-mediated PCR compared with SYBR Green real-time PCR based on testing of 103 clinical samples

3 討論

現(xiàn)已證實，F(xiàn)AdV-4是引起雞心包積液綜合征的病原體，在雞群中普遍存在，早期致病性弱，病死率低而極少受到關(guān)注。但FAdV-4長期感染可造成免疫抑制，繼而易發(fā)與傳染性囊病、傳染性貧血、雞新城疫、馬立克病等病原的混合感染，致死率可達100%，給肉雞養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失，目前尚無有效疫苗。由于FAdV 血清型眾多，加上多病原混合感染、病毒基因重排及毒力演變，致使病情復(fù)雜，給疫病防控造成了困難，必須通過實驗室檢測進行確診。

FAdV-4六鄰體hexon基因是被研究最廣泛的基因，編碼Ⅰ亞群腺病毒重要的結(jié)構(gòu)蛋白，具有種屬特異性，既是中和抗體的靶標，也是基因檢測的靶標?；诓《净蚪M的高頻重組及變異性，作者分析hexon基因分子進化特點及序列特征，設(shè)計2條序列相鄰的左、右探針，分別標記于大豆Lectin基因片段兩端，獲得雙探針標記的報告基因(圖1)。檢測時，因特異性雙探針與待檢hexon基因雜交而將報告基因Lectin片段兩端拉近、相鄰，經(jīng)連接后形成環(huán)狀報告基因，再采用1對反向引物F-2和R-2擴增環(huán)化報告基因，實現(xiàn)FAdV-4環(huán)介導(dǎo)PCR檢測。通過優(yōu)化報告基因、酶、dNTPs和引物的用量，成功擴增出1條長度約為360 bp基因片段，序列分析發(fā)現(xiàn)，擴增片段中間含有40 bphexon雜交探針，與NCBI數(shù)據(jù)庫中FAdV-4Hexon基因序列同源性達99%以上，而兩側(cè)則為大豆Lectin基因序列。運用所建立的方法分別檢測FAdV-4、FAdV-4、NDV、IBDV、CIAV、IBV和MDV等病毒核酸樣品，僅有FAdV-4樣品能成功擴增出預(yù)期片段，條帶清晰，而FAdV-4、NDV、IBDV、CIAV、IBV和MDV等其他禽病原體則未見明顯擴增(圖3)，表明該方法特異性強，可有效區(qū)別檢測FAdV-4與其他常見的禽病原體，能檢出FAdV-4的最低核酸濃度為7.85 pg/μL(圖4)，靈敏度高。應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)PCR、常規(guī)PCR和SYBR Green 實時PCR 3種方法對103份疑似病料進行比較檢測，結(jié)果表明(表2)，3種方法對FAdV-4陽性檢出率分別為35.0%、32.0%、35.9%，表明FAdV-4在本省雞群中隱性感染現(xiàn)象比較普遍，提示安卡拉病毒依然在危害著本省雞群，由于FAdV-4感染可能會導(dǎo)致免疫抑制，增加其他病原的易感性，需要做好混合感染和繼發(fā)感染的針對性預(yù)防；環(huán)介導(dǎo)PCR對FAdV-4的陽性檢出率接近定量PCR，而高于常規(guī)PCR，分析原因在于，常規(guī)PCR采用特異性引物直接擴增目的基因進行檢測，對擴增模板的完整性要求較高，樣品新鮮程度、核酸降解與斷裂等情況都會影響擴增結(jié)果，而環(huán)介導(dǎo)PCR則是基于雙探針與目的基因雜交，雙探針長度僅為40 bp， 對模板完整性要求不高，核酸部分降解與斷裂對結(jié)果影響不大，檢測敏感性和特異性相對較高。采用Kappa檢驗法分析環(huán)介導(dǎo)PCR和實時PCR對103份臨床樣品檢測結(jié)果的一致性，發(fā)現(xiàn)2種方法對FAdV-4檢測結(jié)果的Kappa值為0.98，檢測結(jié)果高度符合，可以代替實時PCR應(yīng)用于雞心包積液綜合征病原的臨床檢測。

4 結(jié)論

綜上所述，本試驗所建立的FAdV-4環(huán)介導(dǎo)PCR檢測方法，具有特異性強、敏感性高等優(yōu)點，可用于臨床樣品FAdV-4的檢測，為心包積液綜合征病原學研究、快速檢測以及流行病學調(diào)查提供一種簡單、有效的方法。