牛金利，佘琳曼，李達(dá)怡，黃妙容，羅燕珊，黃錦杏，明月月，馬 驛，彭金菊

(廣東海洋大學(xué)農(nóng)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)系，廣東 湛江 524088)

巴氏桿菌(Pasteurella)是一種人獸共患病的病原菌，分布廣泛，是農(nóng)場和野生動物主要呼吸系統(tǒng)感染病原體之一[1]。主要通過呼吸道和消化道感染，引發(fā)的疾病死亡率高，嚴(yán)重危害動物以及人類的健康[2]。中藥被廣泛應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)，歷史悠久，在防治畜禽疾病方面，其具有抗菌消炎、無殘留、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點[3]?？股匾恢北挥糜谥委熂?xì)菌感染性疾病。大量的臨床實踐及藥理研究表明，合理的中西藥聯(lián)合能夠提高療效，減少耐藥性以及毒副作用的產(chǎn)生，但中藥的化學(xué)成分相對復(fù)雜，藥理作用尚不明確，聯(lián)合使用不當(dāng)可能會導(dǎo)致療效降低，副作用增多，嚴(yán)重時甚至危害生命[4]，因此需通過試驗觀察驗證中藥和中西藥聯(lián)用是否有效。為了篩選出抑菌活性高、安全、毒副作用小的藥物用于防治巴氏桿菌病，本試驗利用微量肉湯二倍稀釋法、微量肉湯稀釋棋盤法測定單藥和藥物聯(lián)合的體外抑菌效果，選取體外抑菌效果較好的中藥和抗生素，通過灌服給人工感染巴氏桿菌的小鼠，觀察單藥和聯(lián)合用藥對其防治效果，為以后聯(lián)合用藥的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株 巴氏桿菌(C48-3)，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.2 中藥和抗菌藥 香附、黃連、山藥、山銀花、益母草、決明子，均購自湛江市中醫(yī)院。阿莫西林、硫酸新霉素、鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考、替米考星、恩諾沙星、頭孢噻呋鈉，均購自深圳容金科技有限公司。

1.3 實驗動物 BALB/c小鼠200只，體重約25～35 g，雌雄各半，購自廣東醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.4 菌液的制備 挑取適量的標(biāo)準(zhǔn)菌株粉末接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h后，挑取單個菌落接種于營養(yǎng)肉湯中，37 ℃培養(yǎng)16～24 h， 采用平板計數(shù)法用營養(yǎng)肉湯把細(xì)菌濃度稀釋至105CFU/mL。

1.5 中藥水提物的制備 采用水煎法提取中藥，將香附、黃連、山藥、山銀花、益母草、決明子等各味中藥分別加熱煮沸30 min，過濾，連續(xù)煎煮3次，冷卻，過濾，合并煎煮藥液，濃縮藥液至相當(dāng)于含生藥1 g/mL。

1.6 抗菌藥藥液的制備 將阿莫西林、硫酸新霉素、鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考、替米考星、恩諾沙星、頭孢噻呋鈉等分別配成1 280 μg/mL。

1.7 中藥對巴氏桿菌最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定 采用試管二倍稀釋法[5]測定各個中藥對巴氏桿菌的MIC，取試管12支，于各試管中加入菌液和藥液，12支試管的中藥含量分別為200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0.391、0.196、0 mg/mL。37 ℃培養(yǎng)16 h觀察結(jié)果。37 ℃培養(yǎng)24 h后劃線于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h觀察結(jié)果，沒有細(xì)菌生長且中藥濃度最小，即為該中藥對該菌株的MBC。

1.8 抗菌藥對巴氏桿菌MIC和MBC的測定 采用微量肉湯稀釋法[6]，測定各個抗菌藥對巴氏桿菌的MIC，取96孔板，于各孔中加入菌液和藥液，使每排12孔中的藥物含量分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0 μg/mL。37 ℃培養(yǎng)16 h觀察結(jié)果。MBC的測定方法與中藥MBC的測定方法相同。

1.9 中西藥聯(lián)合MIC和MBC的測定 選取對巴氏桿菌體外抑菌效果最好的中藥抗菌藥，采用棋盤法[7]測定其聯(lián)合后對巴氏桿菌的抑菌效果。

FIC≤0.5為協(xié)同作用；0.52為拮抗作用。

1.10 小鼠人工感染巴氏桿菌的防治試驗

1.10.1 試驗分組 將小鼠隨機分成5組，每組20只。給藥劑量由體外抑菌試驗測得的MIC、MBC確定。Ⅰ 組為感染細(xì)菌的陽性對照組；Ⅱ組為不感染細(xì)菌的陰性對照組；Ⅲ組為中藥香附組，預(yù)防組和治療組用量分別為25 mg/(g·d)和50 mg/(g·d)；Ⅳ組為抗菌藥恩諾沙星組，預(yù)防組合治療組用量分別為0.5 μg/(g·d)和1 μg/(g·d)；Ⅴ組為香附與恩諾沙星聯(lián)合組，預(yù)防組用藥量香附25 mg/(g·d)、恩諾沙星0.5 μg/(g·d)，治療組用藥量為香附50 mg/(g·d)、 恩諾沙星1 μg/(g·d)。其給藥方式均為灌服。

1.10.2 人工感染試驗 用營養(yǎng)肉湯將巴氏桿菌稀釋成所需濃度，通過皮下注射不同濃度的菌液0.1 mL，篩選能引起小鼠死亡的巴氏桿菌菌液的濃度，在感染后24 h內(nèi)，能夠引起小鼠死亡率超過70%的最小菌液濃度選為攻毒濃度。試驗確定每只小鼠皮下注射濃度為103CFU/mL的細(xì)菌混懸液0.1 mL，陰性對照組每只小鼠皮下注射生理鹽水0.1 mL。治療試驗：攻毒當(dāng)天灌服藥液，連續(xù)給藥3 d，停藥后觀察10 d；預(yù)防試驗：連續(xù)灌服藥物3 d后皮下注射菌液，自攻毒之日起連續(xù)觀察10 d。統(tǒng)計各組死亡小鼠的數(shù)量，按常規(guī)方法對病死小鼠進(jìn)行剖檢，分離組織和體液中的細(xì)菌進(jìn)行革蘭染色鏡檢，確定死亡原因。

1.10.3 防治效果評價 用保護(hù)率進(jìn)行評價：

2 結(jié)果

2.1 單藥對巴氏桿菌的抑菌效果 不同藥物對巴氏桿菌的體外抑菌效果見表1、表2。由表1可知，香附和黃連對巴氏桿菌的抑菌效果最好，MIC均為25 mg/mL，香附的MBC為50 mg/mL，黃連的MBC為200 mg/mL。由表2可知，在供試的7種抗菌藥中，恩諾沙星對巴氏桿菌的抑菌效果最強，MIC為0.5 μg/mL，MBC為1 μg/mL。硫酸新霉素和替米考星對巴氏桿菌的抑菌效果也較好，MIC分別為0.5 μg/mL和2 μg/mL。選取恩諾沙星和香附進(jìn)行下一步試驗。

表1 單味中藥對巴氏桿菌的MIC和MBCTable 1 MIC and MBC of single Chinese medicine against Pasteurella (mg/mL)

表2 不同抗菌藥對巴氏桿菌的MIC和MBCTable 2 MIC and MBC of different antibacterial agents against Pasteurella (μg/mL)

2.2 藥物聯(lián)合對巴氏桿菌的抑菌效果 選取抑菌效果最好的中藥香附與抗菌藥恩諾沙星進(jìn)行聯(lián)合，恩諾沙星和香附聯(lián)用時，恩諾沙星用量為單獨用藥的1/2、香附用量為單獨用藥的1/16即能呈現(xiàn)抑菌效果，F(xiàn)IC指數(shù)=0.56，為累加作用，表明恩諾沙星和香附兩藥聯(lián)用時為相加作用，抑菌效果增強。

2.3 不同藥物對小鼠感染巴氏桿菌病的預(yù)防效果 選取香附和恩諾沙星及其聯(lián)合進(jìn)行防治試驗。預(yù)防試驗結(jié)果見表3，攻毒后陽性對照組小鼠死亡20只，存活率為0%。灌服藥物組的小鼠死亡率與陽性對照組比較均降低；香附、恩諾沙星以及香附和恩諾沙星聯(lián)合對小鼠的保護(hù)率分別為10%、60%、70%。香附與恩諾沙星聯(lián)合組的保護(hù)率最高，對小鼠感染巴氏桿菌病的預(yù)防效果較好。

表3 不同藥物對小鼠感染巴氏桿菌的預(yù)防效果Table 3 Preventive effects of different drugs on infection of Pasteurella in mice

2.4 不同藥物的治療效果 各種藥物對小鼠感染巴氏桿菌病的治療效果見表4，攻毒后陽性對照組小鼠死亡20只，保護(hù)率為0%。灌服藥物組的小鼠死亡率與陽性對照組比較有所降低；香附、恩諾沙星以及香附與恩諾沙星聯(lián)合對小鼠的保護(hù)率分別為25%、75%、80%。香附與恩諾沙星聯(lián)合組的保護(hù)率最高，對感染巴氏桿菌病的小鼠有較好的治療效果。

表4 不同藥物對小鼠感染巴氏桿菌的治療效果Table 4 Therapeutic effect of different drugs on infection of Pasteurella in mice

2.5 病死小鼠的剖檢結(jié)果及細(xì)菌形態(tài)特征 剖檢病死小鼠可見皮膚、黏膜發(fā)紺；心臟脂肪有出血點及灰色壞死病灶，心包積液；肝臟出血；脾臟出血；腎臟出現(xiàn)水腫，有出血、淤血。

分離組織和體液中細(xì)菌進(jìn)行鑒定，染色鏡檢為革蘭陰性、兩極濃染的短桿狀或球桿狀細(xì)菌，符合巴氏桿菌的形態(tài)特征。

3 討論

3.1 抗菌藥物對巴氏桿菌的體外抑菌效果 巴氏桿菌對新霉素、替米考星和恩諾沙星敏感，MIC分別為0.5 μg/mL、2 μg/mL和0.5 μg/mL，其中恩諾沙星的抑菌效果最好。劉紅玉等[8]通過檢測鵝源巴氏桿菌對16種常用抗菌藥的敏感性時發(fā)現(xiàn)，其對喹諾酮類抗生素高度敏感。胡澤兵[9]通過藥敏試驗發(fā)現(xiàn)分離的多殺性巴氏桿菌對恩諾沙星和新霉素高度敏感。張旭等[10]研究發(fā)現(xiàn)，替米考星對禽多殺性巴氏桿菌的MIC為2 μg/mL。中藥以香附、黃連的抑菌效果(25 mg/mL)最強。黃楠等[11]發(fā)現(xiàn)，四黃止痢顆粒方劑的6種中藥中黃連對多殺性巴氏桿菌的抗菌活性最強，MIC為1.563 mg/mL。香附具有鎮(zhèn)痛解熱、抗菌抗炎的功效。香附與恩諾沙星聯(lián)合用藥增強了抑菌效果。

3.2 藥物聯(lián)合對小鼠巴氏桿菌病的防治效果 本試驗中采用香附、恩諾沙星、香附和恩諾沙星聯(lián)用，治療和預(yù)防小鼠巴氏桿菌病的作用與陽性對照組相比有所提高。恩諾沙星對小鼠感染巴氏桿菌病的防治效果較好，保護(hù)率分別為60%和75%。馬驛等[12]研究發(fā)現(xiàn)，恩諾沙星對雞巴氏桿菌病的治療和預(yù)防效果較好，保護(hù)率分別為33.33%和70%。香附對小鼠巴氏桿菌病的防治效果不理想，保護(hù)率分別為10%和25%。香附和恩諾沙星聯(lián)合對巴氏桿菌病的預(yù)防和治療效果比單藥強，保護(hù)率分別為70%和80%。說明香附與恩諾沙星聯(lián)用在預(yù)防小鼠巴氏桿菌病中能夠降低巴氏桿菌對恩諾沙星的耐藥性，配合香附一起使用更充分發(fā)揮藥物的作用。

3.3 藥物聯(lián)合在疾病防治中的作用 抗生素一直是治療細(xì)菌性疾病的首選藥物，但抗菌藥具有毒副作用，易引發(fā)雙重感染，隨著抗菌藥的大量使用，細(xì)菌易出現(xiàn)耐藥性和藥物殘留，給人類健康造成威脅[13]。胡星星等[14]研究發(fā)現(xiàn)，分離的55株巴氏桿菌對臨床常用抗菌藥都產(chǎn)生了耐藥性。而中藥具有抗炎消炎，不易產(chǎn)生耐藥性的特點，重在提高機體的免疫能力，平衡機體的各項功能，還能提高其對抗生素的敏感性[15]。高艷等[16]發(fā)現(xiàn)，翼草景香水煎液對多殺性巴氏桿菌具有良好的體內(nèi)、外抑菌活性。中西藥的聯(lián)合使用在治療和預(yù)防巴氏桿菌病方面得到認(rèn)可。由黃連、黃芩等中藥和氟苯尼考聯(lián)合，對鴨禽霍亂的防治效果明顯[17]。裴立峰[18]研究發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方結(jié)合雙氟沙星、氧氟沙星等西藥對禽霍亂的治愈率達(dá)91.5%。這充分體現(xiàn)了中西藥結(jié)合的優(yōu)勢，但其抑菌成分和機理不明確，盲目的使用和濫用，仍會使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，降低療效。因此需對其進(jìn)行深入的研究，合理進(jìn)行藥物聯(lián)合。