魯冠杰，馬維超，張 倩,2，穆 祥，胡 格

[1. 北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室，北京 昌平 102206；2. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀 100193]

目前，仔豬腹瀉在規(guī)?；B(yǎng)豬場甚至是養(yǎng)殖戶中都很常見，其發(fā)病率很高，由腹瀉引起的仔豬死亡數(shù)占仔豬死亡總數(shù)30%以上，對養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[1-2]。其中大腸桿菌是導(dǎo)致仔豬腹瀉的最常見的原因[3]，是全世界生豬生產(chǎn)經(jīng)濟上重要的疾病。產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)是引起仔豬水樣腹瀉最常見的病原體[4-5]，仔豬腹瀉通常與產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的大量增殖產(chǎn)生腸毒素有關(guān)[6]。大腸桿菌腸毒素包括熱敏腸毒素(Heat labile enterotoxin，LT)和耐熱腸毒素(Heat stable enterotoxin，ST)，其中大腸桿菌熱敏腸毒素具有抗原性，是AB5細(xì)菌毒素家族的成員[6]，在人類中，LT會導(dǎo)致類似霍亂的疾病，并伴有水樣腹瀉和胃痙攣。在動物中，LT陽性ETEC通常會產(chǎn)生F4菌毛和STb，其發(fā)病的特征是仔豬腹瀉后的脫水甚至生長遲緩，表明這些毒力因子之間可能存在功能聯(lián)系。豬環(huán)境中ETEC的存在是病原體傳播的重要因素，因為這些細(xì)菌在受到糞肥保護后能夠存活至少6個月[7-8]。本試驗旨在利用產(chǎn)熱敏腸毒素大腸桿菌和熱敏腸毒素建立仔豬動物模型，并在模型基礎(chǔ)上檢測相關(guān)的生理生化指標(biāo)和病理指標(biāo)來探討與其證候的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 蘇木精-伊紅(H.E.)染色試劑盒(批號為C0105),購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；4%多聚甲醛(批號為BL539A),購自西安風(fēng)騰生物有限公司；注射用生理鹽水(批號為HG/T3491-1999),購自四川科林藥業(yè)股份有限公司；麥康凱培養(yǎng)基，由獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室配置保存；菌株：標(biāo)準(zhǔn)LT陽性菌株CVCC197，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；LT蛋白：獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室保存，濃度為0.65 mg/mL[9]。

1.2 實驗動物 長白豬12頭，22日齡，雌、雄各半，購自北京久久豐實驗動物基地。

1.3 試驗方法

1.3.1 體重指標(biāo) 對試驗前、后記錄的體重數(shù)據(jù)進行整理，計算平均日增重。

1.3.2 動物模型的建立 12頭22日齡長白豬隨機分為A組(空白對照組)、B組(細(xì)菌組)、C組(毒素組)，每組4只，公母各半。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，飼養(yǎng)溫度(20±2) ℃，飼喂乳豬配合飼料，自由取食，飲水。A組、B組分別灌胃給予生理鹽水、細(xì)菌懸液，100 mL/只(108CFU/mL)；C組腹腔注射給予LT，10 mL/只，LT濃度0.5 mg/mL。

1.3.3 動物模型生理生化指標(biāo)的測定 試驗前以及試驗開始后的不同時期對各組進行前腔靜脈采血，進行血常規(guī)和血液生化指標(biāo)檢測。

1.3.4 病理剖檢 常規(guī)處死發(fā)病豬，打開腹腔后檢查腹腔有無積液，各個臟器的位置有無典型性變化。如果有典型性病變，采集病變組織并進行固定切片，組織切片進行H.E.染色。

1.3.5 免疫組化檢測組織中LT 將1.3.4中固定好的組織進行免疫組化試驗檢測其中LT的含量。

2 結(jié)果

2.1 平均日增重分析 對各組豬進行平均日增重分析，見表1。細(xì)菌組和毒素組平均日增重負(fù)增長明顯，極顯著低于對照組(P<0.01)。

表1 平均日增重Table 1 Average daily gain

2.2 血常規(guī)指標(biāo)檢測 經(jīng)過血液常規(guī)分析：試驗前各組間各指標(biāo)(表2)均無顯著差異(P>0.05)；試驗結(jié)束后(表3)，與對照組相比，細(xì)菌組淋巴細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)，白細(xì)胞數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)顯著增多(P<0.05)；毒素組淋巴細(xì)胞數(shù)顯著減少(P<0.05)，白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)極顯著增多(P<0.01)。與細(xì)菌組相比毒素組各項數(shù)據(jù)均無顯著差異(P>0.05)。綜上，2個模型在血常規(guī)指標(biāo)方面，白細(xì)胞數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)均有所升高，淋巴細(xì)胞數(shù)均有所降低，而且細(xì)菌組與毒素組相比無顯著差異(P>0.05)， 說明2個試驗組具有相似的機體反應(yīng)。

表2 試驗前各組血常規(guī)指標(biāo)分析Table 2 Analysis of blood routine indicators of each group before the test

表3 試驗結(jié)束后各組血常規(guī)指標(biāo)分析Table 3 Analysis of blood routine indicators of each group after the end of the experiment

2.3 血液生化指標(biāo)檢測 經(jīng)過血液生化指標(biāo)分析，試驗前與對照組各組各項指標(biāo)變化差異較大，并不能篩選出具有典型性的生化指標(biāo)，如表4、表5所示。

表4 試驗前血液生化指標(biāo)分析Table 4 Analysis of blood biochemical indicators before the test (n=4)

表5 試驗結(jié)束后血液生化指標(biāo)分析Table 5 Analysis of blood biochemical indicators after the end of the experiment

2.4 病理剖檢 如中插彩版圖1、2所示，細(xì)菌組胃膨脹充滿，漿膜血管多淤血、怒張，呈樹狀；幽門部黏膜輕度潮紅。小腸內(nèi)有黃色至灰綠色水狀液體，混有氣泡，有惡臭氣味；小腸、結(jié)腸黏膜面上有較多的黏液，呈卡他性炎癥變化，腸管失去彈性，嚴(yán)重脫水。腸系膜淋巴結(jié)充血、水腫呈黃白色串珠狀。肺輕度淤血、腫大，有實質(zhì)性病變。毒素組不僅表現(xiàn)出相似的腸道病變而且腹腔積液嚴(yán)重，腸系膜嚴(yán)重水腫，腸系膜淋巴結(jié)呈白色串珠狀；肺臟淤血實質(zhì)性病變嚴(yán)重；胸腔積液嚴(yán)重；有大量心包積液；肝臟邊緣有出血點。

圖1 細(xì)菌組剖檢病變Fig.1 Bacterial group necropsy lesionsA：細(xì)菌組肺臟腫大，點狀出血，實質(zhì)性病變嚴(yán)重； B、C、D：小腸和腸系膜充血，松弛，腸腔充滿液體； E：小腸內(nèi)鼓氣混有泡沫，黏液A：Bacteria group lung enlargement,spotted hemorrhage,and serious substantive lesions; B,C,D：Small intestine and mesentery are congested and relaxed,and the intestinal cavity is filled with liquid； E：Inflation in the small intestine is mixed with foam and mucus

圖2 毒素組剖檢病變Fig.2 Toxin group necropsy lesionsA：毒素組肺臟大面積實質(zhì)性病變，淤血； B:小腸和腸系膜水腫； C、D：腹腔積液、心包積液，胸腔積液嚴(yán)重； E肝臟點狀出血A：Toxic group large lung substantial lesions,congestion; B：Small intestine and mesenteric edema;C, D:Ascites,pericardial effusion,severe pleural effusion; E:Liver spotted bleeding

2.5 病理組織學(xué)檢查 對照組肺泡壁分界清晰，肺泡內(nèi)無異物，未見炎性細(xì)胞，肺泡細(xì)胞染色均勻，細(xì)胞核形狀一致。細(xì)菌組出現(xiàn)明顯的組織結(jié)構(gòu)變化，肺泡出現(xiàn)病區(qū)變實，肺泡壁分界不清楚，無正常肺泡或肺泡壁變窄，肺泡腔內(nèi)滲出物主要是中性粒細(xì)胞和紅染細(xì)網(wǎng)狀的纖維素，染色不均，形態(tài)出現(xiàn)改變。毒素組肺組織發(fā)生實變，部分肺泡破裂、融合,而有的肺泡代償性肥大，間質(zhì)結(jié)締組織增生顯著。見封三彩版圖3。

圖3 肺組織H.E.染色 (200×)Fig.3 H.E. staining of lung tissue (200×)A：對照組； B：細(xì)菌組； C：毒素組A:Control group; B：Bacterial group； C：Toxin group

組織切片可見對照組空腸腸壁較厚，腸絨毛結(jié)構(gòu)完整未見脫落，腸道結(jié)構(gòu)正常；細(xì)菌組腸壁變薄，黏膜下層充滿液體，腸絨毛變短脫落，上皮細(xì)胞腫脹，腸腺出血，杯狀細(xì)胞增多；毒素組腸壁變薄，黏膜間質(zhì)充滿液體，腸黏膜脫落變短，腸黏膜上皮腫脹，腸腺完全被破壞呈現(xiàn)空泡狀結(jié)構(gòu)，杯狀細(xì)胞增多；部分固有膜、黏膜下層、肌層有少量的紅細(xì)胞。見封三彩版圖4。

圖4 空腸組織H.E.染色 (200×和400×)Fig.4 H.E. staining of jejunal tissue (200× and 400×)A：對照組(200×)； B：細(xì)菌組(200×); C：毒素組(200×); D：對照組(400×)； E：細(xì)菌組(400×)； F：毒素組(400×)A:Control group(200×)； B:Bacteria group(200×)； C:Toxin group (200×); D:Control group(400×)； E:Bacteria group(400×)； F:Toxin group(400×)

2.6 小腸黏膜組織形態(tài)檢測 與對照組相比，細(xì)菌組十二指腸腸壁極顯著變薄(P<0.01)，腸絨毛極顯著變短(P<0.01)；空腸腸壁顯著變薄(P<0.05)，絨毛長度顯著變短(P<0.05)；回腸腸壁極顯著變薄(P<0.01)，絨毛長度極顯著變短(P<0.01)。毒素組十二指腸絨毛極顯著變短(P<0.01)；空腸腸壁極顯著變薄(P<0.01)，絨毛長度極顯著變短(P<0.01)；回腸腸壁極顯著變薄(P<0.01)，絨毛長度極顯著變短(P<0.01)。見圖5。

圖5 小腸黏膜組織形態(tài)分析Fig.5 Analysis of small intestinal mucosa morphology

2.7 血液中LT檢測以及免疫組化檢測 采用WB的方法對各組樣品血清進行檢測，檢測結(jié)果表明，各試驗組血清中LT含量低于10 ng/mL，血清中毒素含量達(dá)不到檢測范圍。免疫組化在試驗組空腸組織檢測到少量LT存在。見封三彩版圖6。

圖6 空腸組織免疫組化圖片 (200×)Fig.6 Immunohistochemistry pictures of jejunum (200×)A：對照組； B：細(xì)菌組； C：毒素組A：Control group； B：Bacterial group； C：Toxin group

3 討論

本試驗建立的產(chǎn)熱敏熱敏腸毒素大腸桿菌病模型的發(fā)病機理目前尚未清楚，對靶器官了解的還不夠全面，對血液生理生化的病理學(xué)研究更是稀少[10]。因此對生化指標(biāo)進行研究，了解血液病理學(xué)，為進一步研究仔豬腹瀉的發(fā)病機理和作用的靶器官提供理論基礎(chǔ)[11]。試驗結(jié)果中，與對照組相比，試驗前(表2)各組間血常規(guī)各指標(biāo)均無顯著差異(P>0.05)，試驗后(表3)2個模型組白細(xì)胞數(shù)和中性粒細(xì)胞數(shù)均有所升高，淋巴細(xì)胞數(shù)均有所降低，而且細(xì)菌組與毒素組相比無顯著差異(P>0.05)，說明2個試驗組具有相似的機體反應(yīng)。免疫組化試驗中在空腸組織中可以檢測到少量的LT的存在，而WB試驗中不能檢測出，說明LT在體內(nèi)含量極少；病理剖解的結(jié)果中,與正常組相比，毒素組的病變情況比細(xì)菌組的腸道和肺臟的病變嚴(yán)重，說明產(chǎn)熱敏腸毒素與熱敏腸毒素大腸桿菌病具有必然的聯(lián)系。

與細(xì)菌組和病毒組比較，正常組的小腸上皮細(xì)胞中杯狀細(xì)胞較少，絨毛密集，其作用是杯狀細(xì)胞能緩慢分泌少量黏液，在黏膜表面形成疏水的黏液凝膠層，潤滑和保護上皮細(xì)胞網(wǎng)[12]。結(jié)果中細(xì)菌組和毒素組腹瀉嚴(yán)重破壞了腸道黏膜完整性，大量腸絨毛脫落，腸壁變薄，間質(zhì)充水，脫落的黏膜和壞死細(xì)胞掉落在腸腔內(nèi)與杯狀細(xì)胞分泌的黏液一起形成膿性分泌物。小腸是執(zhí)行身體營養(yǎng)吸收的主要器官，其主要吸收功能來自于小腸絨毛；小腸絨毛是由小腸上皮和固有層一同向腸腔內(nèi)突出的突起，突起越多腸道吸收營養(yǎng)物質(zhì)的面積越大，各試驗組小腸絨毛大量脫落，引起了一系列腸道炎癥反應(yīng)[13]。建立產(chǎn)熱敏腸毒素大腸桿菌模型能夠有效的了解熱門腸毒素仔豬模型和產(chǎn)熱敏腸毒素大腸桿菌模型的病理模型的聯(lián)系，推論證明得出熱敏腸毒素是產(chǎn)熱敏腸毒素大腸桿菌病的主要致病原因。