袁巧云, 張建梅, 唐 鈺, 張 良, 顧 倩, 尚 志, 胡衛(wèi)成

(淮陰師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院, 江蘇 淮安 223300)

0 引言

新疆風(fēng)味調(diào)和茶是新疆保健茶類的一種,迄今已有1600多年歷史.明朝談修在《滴露漫錄》中就有所指:以其腥肉之食,非茶不消;青稞之熱,非茶不解[1]．新疆人民根據(jù)傳統(tǒng)醫(yī)藥知識(shí)和日常生活經(jīng)驗(yàn),以茶為基礎(chǔ),添加多種藥食兩用植物,總結(jié)和實(shí)踐出的一系列用于日常調(diào)養(yǎng)以增加營(yíng)養(yǎng)[2],預(yù)防疾病的功能性飲品,形成了獨(dú)具特色的新疆風(fēng)味調(diào)和茶,茶水湯色紅濃,滋味芳香,醇厚可口[3]．同時(shí)維吾爾醫(yī)學(xué)認(rèn)為常飲調(diào)和茶具有消除疲勞、舒肝養(yǎng)胃、祛風(fēng)驅(qū)寒、提神壯腎和利尿的神奇功效,其配方一年四季均有不同,會(huì)產(chǎn)生不同的功效,夏季可以消暑生津解渴,冬季則有增加熱量和御寒的功效[4]．

總糖即為糖類物質(zhì)的總量,包括各種單糖、雙糖及多糖中的淀粉,其中多糖是糖天然存在的重要形式[5]．多糖是由10個(gè)以上的單糖通過(guò)糖苷鍵連接形成的含醛基或酮基的天然高分子聚合物[6],是參與生命活動(dòng)與代謝調(diào)節(jié)的重要成分,具有多種生物活性功能和藥理活性[7-9],如：抗腫瘤、抗炎、增加免疫力、降血糖[10]、抗輻射、降血脂、保肝等[11]．

已有文獻(xiàn)對(duì)新疆風(fēng)味調(diào)和茶營(yíng)養(yǎng)成分或與其功效相關(guān)的活性成分進(jìn)行了研究分析[12-13],但尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于該茶糖類成分分析的相關(guān)報(bào)道．本文以新疆風(fēng)味調(diào)和茶為原料,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò)響應(yīng)面法[14-16]優(yōu)化其總糖的提取工藝,為新疆風(fēng)味調(diào)和茶的進(jìn)一步研發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和研究資料．

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新疆風(fēng)味調(diào)和茶是由多種原料混合研磨制成,配方如下:豆蔻3 g，紅花6 g，玫瑰6 g，丁香0.6 g，薄荷4 g，小茴香3 g，甘草2 g，干姜0.6 g，姜黃1 g，茯磚茶30 g. 經(jīng)單獨(dú)研磨后,過(guò)18目篩,24 h凍干處理后,混合．葡萄糖(分析純),濃硫酸(分析純),5%苯酚(分析純),化學(xué)品均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司．

ALPHA1-2型冷凍干燥機(jī)(德國(guó)Christ公司);HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇億通電子有限公司);5810R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司); DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);Tecan Infinite M200 Pro型酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)．

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總糖提取方法

稱取一定量的新疆風(fēng)味調(diào)和茶粉末,于一定溫度水浴鍋中水浴提取一定時(shí)間,每30 min振動(dòng)離心管,充分混勻料液．水浴完畢,4 000 r/min離心10 min,收集上清液定容至50 mL．取5 mL定容后的溶液冷凍在-20℃冰箱．各取5 mL經(jīng)處理的冷凍樣品水浴化開(kāi),渦旋振蕩(2 800 r/min, 0.5 min),每個(gè)樣品各取1 mL,4 000 r/min離心10 min．

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品50 mg,用水溶解于50 mL的容量瓶中定容,配制成1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液．

分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0,50,100,200,300,400和500 μL置于10 mL試管中,各加超純水至1 mL,再依次加入1 mL配制好的5%苯酚溶液,5 mL濃硫酸,移至渦旋儀,渦旋至混合均勻無(wú)分層,將試管置于30℃水浴鍋中水浴30 min,移至渦旋儀上渦旋．依次吸取200 μL的溶液于96孔板,置于酶標(biāo)儀中在波長(zhǎng)為490 nm處,測(cè)其OD值．以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)方程為:Y=0.0062X+0.0078,R2=0.9994．式中:Y為吸光度,X為總糖質(zhì)量濃度(g/mL)．

1.2.3 總糖提取量測(cè)定

稱取0.5 g新疆風(fēng)味調(diào)和茶粉末,加超純水溶解,水浴加熱,4 000 r/min下離心10 min,取上清液定容至50 mL容量瓶,得到待測(cè)樣品溶液．取500 μL樣品溶液,用苯酚-硫酸法測(cè)定總糖的含量,按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法,測(cè)定樣品的OD值,根據(jù)回歸方程計(jì)算得到新疆風(fēng)味調(diào)和茶溶液中總糖的提取量．

1.2.4 總糖提取單因素實(shí)驗(yàn)

1) 提取溫度對(duì)總糖提取的影響

分別稱取0.5 g新疆風(fēng)味調(diào)和茶粉末于50 mL離心管中,按料液比1:30 g/g加入超純水,混合均勻,分別于60,70,80,90和100℃條件下浸提2 h,考察不同溫度對(duì)新疆風(fēng)味調(diào)和茶總糖提取量的影響．

2) 提取時(shí)間對(duì)總糖提取的影響

分別稱取0.5 g新疆風(fēng)味調(diào)和茶粉末于50 mL離心管中,按料液比1:30 g/g加入超純水,混合均勻,于90℃條件下,分別浸提0.5,1.0,1.5,2.0,2.5和3.0 h,考察不同提取時(shí)間對(duì)新疆風(fēng)味調(diào)和茶總糖提取量的影響．

3) 料液比對(duì)總糖提取的影響

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素與水平

分別稱取0.5 g新疆風(fēng)味調(diào)和茶粉末于50 mL離心管中,料液比1:10,1:20,1:30,1:40和1:50 g/g依次加入超純水,混合均勻,于90℃條件下,浸提2 h,考察不同料液比對(duì)新疆風(fēng)味調(diào)和茶總糖提取量的影響．

1.2.5 響應(yīng)面分析法對(duì)提取工藝的優(yōu)化

根據(jù)以上單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果確定因素水平范圍,依據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理得到本次實(shí)驗(yàn)中影響新疆風(fēng)味調(diào)和茶總糖提取因素分別如下:提取溫度為80,90和100℃,提取時(shí)間為1.5,2.0和2.5 h,料液比為1:20,1:30和1:40(g/g),按測(cè)定總糖量的方法,應(yīng)用響應(yīng)面分析法對(duì)新疆風(fēng)味調(diào)和茶的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化．實(shí)驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1．

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溫度對(duì)總糖提取量的影響

由圖1可知,隨著提取溫度的升高,新疆風(fēng)味調(diào)和茶總糖提取率逐漸升高,當(dāng)提取溫度由60℃上升到70℃時(shí),新疆風(fēng)味調(diào)和茶總糖提取率上升較快,說(shuō)明含糖量增加幅度大．當(dāng)提取溫度80℃到100℃時(shí),曲線趨勢(shì)比較平穩(wěn),當(dāng)提取溫度達(dá)到100℃時(shí),總糖提取量的得率最高為7.89%,由于高溫可能影響到多糖的結(jié)構(gòu)與其活性,當(dāng)提取溫度超過(guò)100℃時(shí),多糖易降解失活,所以選擇100℃為新疆風(fēng)味調(diào)和茶總糖提取的最適溫度．

2.1.2 時(shí)間對(duì)總糖提取量的影響

由圖2可知,隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),新疆風(fēng)味調(diào)和茶總糖提取量呈升高的趨勢(shì)．在0.5-2 h的范圍內(nèi),相應(yīng)的含糖量顯著增加．當(dāng)提取時(shí)間為2 h時(shí),總糖的得率為7.60%,將時(shí)間延長(zhǎng)到2.5 h后,總糖的得率只增加了0.01%,為了縮短加工時(shí)間,減少能源消耗,故選擇2 h為新疆風(fēng)味調(diào)和茶總糖的最佳提取時(shí)間．

圖1 提取溫度對(duì)總糖提取率的影響 圖2 提取時(shí)間對(duì)總糖提取率的影響

2.1.3 料液比對(duì)總糖提取量的影響

由圖3可知,新疆風(fēng)味調(diào)和茶的總糖提取量隨料液比的增大而增加．當(dāng)料液比從1:10增大到1:20,總糖得率增加了1.98%,說(shuō)明料液比對(duì)其影響顯著．當(dāng)料液比為1:40,1:50時(shí),其提取率之間無(wú)顯著差異,為了節(jié)約成本,選擇料液比為1:40(g/g)較為合適．

圖3 料液比對(duì)總糖提取率的影響

表2 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,選取有較顯著影響的提取溫度,提取時(shí)間,料液比,分別以A,B,C表示,以總糖提取量為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析(Design Expert V8.0.6軟件),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2．

表3 方差分析結(jié)果

2.2.2 回歸模型建立與顯著性分析

根據(jù)Design Expert V8.0.6軟件處理,由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)所得新疆風(fēng)味調(diào)和茶總糖提取量與提取溫度,提取時(shí)間,料液比的二次多元回歸方程為:Y=848.14+42.20A+3.39B+61.49C-4.71AB-14.82AC+2.87BC+6.84A2-3.58B2+0.93C2

由表3回歸方程方差分析結(jié)果可知,由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)所得模型的p值為0.0014,表示該模型具有極顯著性,回歸方程中因素A-溫度和C-料液比對(duì)新疆風(fēng)味調(diào)和茶提取總糖量影響極顯著,且兩因素中的因素C-料液比對(duì)提取量的影響更加顯著其他因素不顯著．根據(jù)方程變量系數(shù)大小可知,影響總糖提取量的因素依次是:C-料液比>A-溫度>B-時(shí)間．

圖4 任意兩變量對(duì)總糖提取率影響的響應(yīng)等高線圖

2.2.3 響應(yīng)面分析與提取工藝優(yōu)化

根據(jù)提取溫度,提取時(shí)間和料液比對(duì)新疆風(fēng)味調(diào)和茶總糖的提取量的影響,繪制響應(yīng)等高線圖．由圖4可知,提取溫度,提取時(shí)間和料液比對(duì)新疆風(fēng)味調(diào)和茶總糖的提取量都有影響且三者之間存在交互作用．利用Design Expert V8.0.6軟件進(jìn)行模擬計(jì)算,以總糖提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo),得到新疆風(fēng)味調(diào)和茶提取的最優(yōu)工藝是:提取溫度100℃,提取時(shí)間2.02 h,料液比1:40．為了驗(yàn)證響應(yīng)面最優(yōu)提取工藝數(shù)據(jù)的有效性,采用最優(yōu)工藝對(duì)新疆風(fēng)味調(diào)和茶進(jìn)行提取驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得總糖提取量為944.35 g/mL,與響應(yīng)面法模擬出的理論值944.84 μg/mL基本一致,說(shuō)明回歸方程與實(shí)際情況擬合較好,響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了該優(yōu)化工藝的可靠性．

3 結(jié)論

以總糖提取量為評(píng)價(jià)指標(biāo),在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用苯酚-硫酸法建立新疆風(fēng)味調(diào)和茶的總糖測(cè)定方法,應(yīng)用響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化,用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理得到新疆風(fēng)味調(diào)和茶總糖提取的最優(yōu)工藝為:提取溫度100℃,提取時(shí)間2.02 h,料液比1:40．采用以上最優(yōu)工藝對(duì)新疆風(fēng)味調(diào)和茶進(jìn)行實(shí)驗(yàn),得到總糖提取量為944.35 g/mL,接近于響應(yīng)面法模擬所得出的理論值,說(shuō)明該優(yōu)化工藝較為可靠．

新疆風(fēng)味調(diào)和茶具有較廣泛的營(yíng)養(yǎng)、保健和藥理功效,深入研究該調(diào)和茶的無(wú)機(jī)鹽、氨基酸及糖類等營(yíng)養(yǎng)成分并研究活性成分的藥效機(jī)制具有重要意義．本文優(yōu)化了新疆風(fēng)味調(diào)和茶總糖的提取工藝,為大量制備活性糖類成分,進(jìn)一步研究新疆風(fēng)味調(diào)和茶的功效和工業(yè)化生產(chǎn)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和研究資料．