徐孝青，魯紅林，張安潔，肖望成，楊 勇，曾 成，代飛燕

(1.云南農業(yè)大學動物醫(yī)學院，云南 昆明 650201；2. 昆明市瀕危動植物收容拯救中心，云南 昆明 650100)

寬吻海豚(Bottlenosedolphins)是鯨目海豚科寬吻海豚屬的一種，主要分布于大西洋、太平洋、黑海、紅海等溫熱帶和熱帶海洋中，在中國主要分布于南海、黃海、渤海、東海及臺灣和香港海峽等海域，以淺海為主要活動區(qū)域[1]，主食為魚類，雌性壽命在80歲左右，雄性壽命一般在50歲。2012年，寬吻海豚被列入《世界自然保護聯盟》(IUCN)瀕危物種紅色名錄，屬國家二級保護野生動物。

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)屬弧菌科氣單胞菌屬，革蘭陰性桿菌，廣泛分布于自然界的水體中[2]，是水生動物常見的致病菌之一[3]；多發(fā)于草魚、鳊、黃鱔等淡水養(yǎng)殖魚類[4]。嗜水氣單胞菌能夠導致水產動物體表、各個組織臟器呈現出血性炎癥并引起大量死亡[5-7]，給水產養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重危害，近年來已經引起人們的廣泛重視[8]。昆明某海洋館人工飼養(yǎng)的5月齡寬吻海豚死亡前精神沉郁，腹瀉不食，全身多處皮膚潰爛，發(fā)病期間使用四環(huán)素拌喂無效。通過剖檢病死海豚，采集病變部位進行細菌分離鑒定及藥敏試驗，分析海豚發(fā)病的原因，選擇有效的治療藥物，為同群海豚的治療提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 病料 病料樣品取自昆明某海洋館死亡海豚1只，5月齡，體長286 cm，尾鰭62 cm，背鰭寬40 cm，高20 cm，胸鰭左右均為37 cm，吻長9 cm。

1.2 病理剖檢 先觀察海豚整體外觀，再對死亡海豚表面進行清洗(用滅菌生理鹽水沖洗3～4次)。無菌條件下用高壓滅菌過的解剖器械解剖海豚，觀察死亡海豚各組織器官的病理變化，采取病變組織，做好記錄。

1.3 細菌分離培養(yǎng) 無菌條件將接種環(huán)燒紅冷卻后挑取病料中間部位，用三區(qū)劃線法將病料接種于血液瓊脂培養(yǎng)基上，在恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃條件下培養(yǎng)16～18 h， 選取優(yōu)勢菌群，挑選優(yōu)勢菌落進行涂片、染色、鏡檢。挑出單個菌落劃線純培養(yǎng)，最后轉移至營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基上，在恒溫搖床(200 r/min、37 ℃)中培養(yǎng)16～24 h,觀察記錄結果。

1.4 PCR擴增 以病原菌的基因組為PCR模板，采用細菌16S rRNA通用引物(正向引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增。PCR 反應條件為:95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。將PCR產物進行凝膠電泳，于紫外成像分析儀中成像。

1.5 測序比對并構建系統(tǒng)發(fā)育樹 將PCR產物送至昆明碩擎生物有限公司進行測序，將測序結果在NCBI上進行同源性比對并構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 細菌生化鑒定試驗 將分離純化的菌株穿刺接種于細菌生化反應微量鑒定管中，培養(yǎng)18～36 h，參考細菌學手冊[9]對結果進行判定。

1.7 動物回歸試驗 自昆明醫(yī)科大學購進SPF昆明系小鼠，公母各半，分為2組，每組4只，將濃度為1.0×108CFU/mL的菌液腹腔接種試驗組SPF小鼠，每只0.5 mL；對照組相同方法注射等量生理鹽水。觀察記錄小鼠的臨床癥狀及死亡時間。

無菌解剖室剖檢SPF小鼠，觀察組織器官病理變化，無菌采取小鼠的病變部位進行細菌分離培養(yǎng)、革蘭染色鏡檢、16S rRNA序列測定，再與原菌株比對。

1.8 藥敏試驗 按標準紙片法(K-B法)對分離的細菌進行藥敏試驗[10]。根據鏡檢結果，挑選出針對革蘭陰性菌抗菌活性較強的10種藥敏紙片，將擴增好的菌液吸取200 μL分別注入2個普通瓊脂培養(yǎng)基中，用無菌的三角棒將細菌均勻涂布到普通瓊脂培養(yǎng)基上，貼片完成后，將平板倒置在37 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，測量抑菌圈直徑，統(tǒng)計分析結果。

2 結果

2.1 病理剖檢 死亡海豚剖檢可見腹腔內有淡黃色黏稠液體；肝臟、腎臟腫大，腎臟包膜積液；部分肺臟出血壞死并伴有纖維素性滲出；腸道有點狀出血。

2.2 菌落形態(tài)及鏡檢 結果顯示，從發(fā)病死亡海豚肺臟、腎臟積液、肝臟中均分離純化得到優(yōu)勢菌株各1株；參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》觀察菌株[11]，均為圓形白色菌落并具有溶血環(huán)；鏡檢結果顯示，分離到的細菌均為革蘭陰性桿菌，兩端鈍圓，無芽孢，無莢膜。見中插彩版圖1、圖2。

圖1 血液瓊脂培養(yǎng)基Fig.1 Blood AGAR medium

圖2 細菌染色鏡檢結果Fig.2 Microscopic examination results of bacterial staining

2.3 PCR擴增 利用16S rRNA基因序列設計的引物擴增，獲得的產物經凝膠電泳后在凝膠成像系統(tǒng)中分析，目的片段大約在1 500 bp(如圖3)。

圖3 16S rRNA的PCR擴增結果Fig.3 PCR amplification of 16S rRNA1:肺臟分離菌； 2:腎包膜積液分離菌； 3:肝臟分離菌；M： Marker(100～2 000 bp)1: Isolated bacteria from lung； 2: Isolation of bacteria from renal capsule effusion; 3:Isolated bacteria from liver;M：Marker(100～2 000 bp)

2.4 序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建 PCR產物送至昆明碩擎生物有限公司進行測序。將測序結果在NCBI中運用BLAST軟件進行同源性分析，結果顯示，3株病原菌與嗜水氣單胞菌的DNA的序列相似度分別為99.43%、99.62%、99.25%。綜合分析并構建系統(tǒng)發(fā)育樹，進一步確認分離出的病原菌均為嗜水氣單胞菌(如圖4)。

圖4 分離菌株與相關菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences between X-1 isolate and the related strains1:肺臟分離菌； 2:腎包膜積液分離菌； 3:肝臟分離菌; M:Marker(100～2 000 bp)1:Isolated bacteria from lung； 2:Isolation of bacteria from renal capsule effusion;3:Isolated bacteria from liver; M：Marker(100～2 000 bp)

2.5 細菌生化鑒定 分離得到的菌株生化鑒定結果顯示，分離菌能夠使葡萄糖，阿拉伯糖產酸產氣，甲基紅試驗變色；使七葉苷、麥芽糖、蔗糖、甘露醇、水楊苷產酸。動力試驗、吲哚試驗均為陽性，對比結果后發(fā)現分離菌與嗜水氣單胞菌的生化特性相符(見表1)。

表1 生化鑒定

2.6 動物回歸試驗 試驗組SPF昆明系小鼠在接種菌液后精神沉郁、腹圍增大，4 h后開始死亡，16 h后全部死亡。剖檢死亡小鼠，試驗組均出現腸道脹氣，肝腎出血腫脹，肺臟出血癥狀；對照組小鼠不表現任何癥狀。于死亡小鼠肝臟、肺臟、腎臟中回收到的菌株，菌落形態(tài)、鏡檢結果、生化鑒定結果、PCR擴增測序比對結果與目的菌相同。

2.7 藥敏試驗 病原菌對氟苯尼考、恩諾沙星、諾氟沙星、慶大霉素極度敏感；對卡那霉素、氨芐西林、紅霉素高度敏感；對四環(huán)素，磺胺嘧啶耐藥(見表2)。

表2 藥敏試驗

3 討論

嗜水氣單胞菌是一種條件致病菌，正常情況下可以與水生動物共存而不發(fā)病[13]，只有在外界條件改變或自身免疫力下降時，才有可能引起機體發(fā)病。Rahman等研究顯示,在17 ℃和25 ℃時嗜水氣單胞菌對金魚的致死率最大[14]；儲衛(wèi)華等研究發(fā)現，鱘魚養(yǎng)殖中嗜水氣單胞菌一般多在水溫25 ℃時致病[15]；葉彩燕等研究發(fā)現，在水溫為23 ℃時，人工接種嗜水氣單胞菌于西伯利亞鱘，發(fā)病率高達100%[13]，由此可見，水溫的改變可能是該常在菌發(fā)病的重要因素之一。而該海洋館海豚死亡時間為6月份， 此時海洋館中水溫上升，有利于嗜水氣單胞菌的增殖；該死亡海豚平日主要以淡水魚蝦和混合料為食，與復雜的海洋食物鏈相比，人工飼養(yǎng)海豚的飲食結構相對單一，并且由于海洋館場地有限，無法完全模擬海洋生態(tài)環(huán)境，很有可能導致海豚出現環(huán)境應激，上述情況給海豚帶來的環(huán)境不適和營養(yǎng)缺乏都有可能導致海豚免疫力降低而發(fā)病，且水生動物的疾病相對難以察覺診斷，無法及時控制感染，這也會導致病情的發(fā)展和惡化。

根據以往文獻記載，嗜水氣單胞菌感染的淡水魚類由于種類不同，臨床表現也略有不同。肖艷翼等在發(fā)病死亡的鱘魚中分離出嗜水氣單胞菌，剖檢病魚發(fā)現魚體眼周、硬鱗基部等體表出血，肝臟、腎臟等實質性器官出現不同程度的出血，充血[16]；楊寧等在發(fā)病死亡的羅非魚中分離出嗜水氣單胞菌，剖檢發(fā)現羅非魚感染該細菌后出現鱗片脫落，尾鰭腐爛，肝臟充血、糜爛等癥狀[17]；鄭杰夫等發(fā)現，受嗜水氣單胞菌感染的中華鱉發(fā)生紅脖子病、白底病、腐皮病[18]。昆明某海洋館患病死亡海豚剖檢后發(fā)現，肝臟、肺臟出血腫大，腎包膜積液，腸道點狀出血，部分皮膚潰爛。綜合檢測結果分析，大量嗜水氣單胞菌感染導致體內臟器廣泛性出血而引發(fā)敗血癥可能是海豚死亡的主要原因。

藥敏試驗結果表明,分離得到的菌株對氟苯尼考、恩諾沙星、諾氟沙星、慶大霉素和卡那霉素極度敏感；對氨芐西林、紅霉素高度敏感；對磺胺嘧啶和四環(huán)素低敏；病原菌對多種藥物高度敏感。詢問飼養(yǎng)人員得知，該海洋館常用四環(huán)素類和磺胺類藥物來預防細菌性疾病，因長期使用同種藥物導致細菌產生耐藥性可能是該海豚久治不愈的原因，本次藥敏試驗結果可為該海洋館同群海豚的疾病防治提供科學依據。