張 森，郭倩妤，湯德元，石遠(yuǎn)菊，葉 麗，楊 偉，廖少山

(貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

2019年2月，貴州省某豬場(chǎng)母豬出現(xiàn)部分妊娠母豬流產(chǎn)且流產(chǎn)胎兒發(fā)育不完全，少數(shù)母豬體溫升高，關(guān)節(jié)腫大，呈跪坐姿，采食量減少，腹圍減小。而大多數(shù)母豬在養(yǎng)殖過(guò)程中并無(wú)明顯臨床癥狀，通過(guò)對(duì)流產(chǎn)胎兒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)確診為豬細(xì)小病毒感染，現(xiàn)將該病的診斷結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 病料 病料來(lái)源于貴州省松桃某豬場(chǎng)送檢發(fā)育不完全的流產(chǎn)胎兒4只(如中插彩版圖1～圖4)。

圖1 流產(chǎn)胎兒

圖2 流產(chǎn)胎兒

圖3 流產(chǎn)胎兒解剖圖

圖4 流產(chǎn)胎兒解剖圖

1.2 細(xì)菌培養(yǎng) 無(wú)菌條件下采集流產(chǎn)胎兒的肝臟、肺臟、腎臟、脾臟、心臟和淋巴結(jié)等病料組織，接種于血瓊脂培養(yǎng)基中，需氧、厭氧條件于37 ℃下培養(yǎng) 24～72 h 觀察。

1.3 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中我國(guó)發(fā)表的豬細(xì)小病毒(PPV)NS1基因(GenBank序列號(hào)為:NC001718)、乙型腦炎病毒(JEV)NS1基因(GenBank序列號(hào)為:NC001437)、偽狂犬病病毒(PRV)gB基因(GenBank序列號(hào)為:AY170318)、豬呼吸與繁殖綜合征病毒(PRRSV)ORF6基因(GenBank序列號(hào)為:AY150564)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)ORF2基因(GenBank序列號(hào)為:MG229682.1)、豬瘟病毒(CSFV)E2基因(GenBank序列號(hào)為:LT158502.1)各設(shè)計(jì)1對(duì)引物，引物序列及大小見(jiàn)表1。

1.4 病毒PCR/RT-PCR檢測(cè) 剖檢流產(chǎn)胎兒并采集送檢流產(chǎn)胎兒的心臟、脾臟、肺臟、腎臟、肝臟及腸內(nèi)容物進(jìn)行反復(fù)研磨，使用液氮反復(fù)凍融3次，用勻漿器勻漿20 min后收集勻漿，再將勻漿12 000 r/min 離心10 min，取其上清。嚴(yán)格按照TaKaRa MinBEST Viral DNARNA Extraction Kit Ver.5.0 試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA/RNA進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)行豬細(xì)小病毒、偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒的PCR檢測(cè)，同時(shí)對(duì)豬乙型腦炎病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。反應(yīng)結(jié)束后取5 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%的1×TAE瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)(110 V， 35 min)，用凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。

2 結(jié)果

通過(guò)對(duì)送檢流產(chǎn)胎兒進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，未見(jiàn)菌落形成。對(duì)流產(chǎn)胎兒病料進(jìn)行PPV、JEV、PRV、PRRSV、PCV-2和CSFV的PCR/RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，僅有PPV呈陽(yáng)性，并得到271 bp的目的條帶，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期條帶結(jié)果相符，未檢出JEV、PRV、PRRSV、PCV-2和CSFV的陽(yáng)性條帶(圖5)。確診該養(yǎng)豬場(chǎng)導(dǎo)致母豬流產(chǎn)的病因?yàn)樨i細(xì)小病毒感染。

圖5 流產(chǎn)胎兒核酸PCR/RT-PCR檢測(cè)結(jié)果M:DL-2 000 Marker; 1:JEV; 2:PPV3:PRV; 4:PPRSV

3 討論

通過(guò)對(duì)送檢流產(chǎn)胎兒進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)及豬細(xì)小病毒(PPV)、乙型腦炎病毒(JEV)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬呼吸與繁殖綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)和豬瘟病毒(CSFV)的PCR/RT-PCR技術(shù)診斷，結(jié)果表明：該豬場(chǎng)是由于母豬感染了PPV導(dǎo)致的母豬流產(chǎn)。鑒于本場(chǎng)的實(shí)際情況，首先應(yīng)該將發(fā)病豬淘汰，對(duì)糞便等污染物及流產(chǎn)胎兒進(jìn)行無(wú)害化處理，對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境徹底消毒，嚴(yán)格檢測(cè)新引進(jìn)種豬，防止該病繼續(xù)擴(kuò)散。

表1 擴(kuò)增目的基因的引物及大小

豬細(xì)小病毒病是由豬細(xì)小病毒(PPV)引起的母豬流產(chǎn)的主要病毒性疾病之一，是一種重要的豬繁殖障礙性疾病，該病毒于1965年在德國(guó)首次發(fā)現(xiàn)，此后世界各國(guó)均有對(duì)該病的報(bào)道，對(duì)世界養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，主要導(dǎo)致初產(chǎn)母豬流產(chǎn)及死胎，而感染細(xì)小病毒的母豬一般沒(méi)有明顯的臨床癥狀出現(xiàn)，感染母豬偶爾會(huì)表現(xiàn)體溫升高、關(guān)節(jié)腫大等特征[1]。豬細(xì)小病毒、乙型腦炎病毒、偽狂犬病病毒、豬呼吸與繁殖綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬瘟病毒都是導(dǎo)致妊娠母豬流產(chǎn)的原因且這幾種病毒容易引起混合感染，然而豬細(xì)小病毒與后5種相比具有妊娠母豬臨床癥狀不明顯的特點(diǎn)，容易被養(yǎng)殖戶(hù)所忽視[2]。因此對(duì)該病的診斷僅從對(duì)臨床癥狀的觀察無(wú)法進(jìn)行確診，需要通過(guò)實(shí)驗(yàn)室PCR/RT-PCR等方式進(jìn)行確診。且本病目前尚無(wú)特效的治療方法，給我國(guó)及全世界養(yǎng)殖戶(hù)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，故需要制定系統(tǒng)化的防疫措施以降低本病的發(fā)生率[3]。如可通過(guò)在母豬配種1個(gè)月前進(jìn)行疫苗接種，使得母豬在整個(gè)妊娠期對(duì)PPV具有抵抗力[4]。

當(dāng)養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)現(xiàn)該病，需對(duì)該養(yǎng)殖場(chǎng)豬只進(jìn)行嚴(yán)格檢測(cè)，若發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性豬需要立即進(jìn)行撲殺，防止傳染以減少損失。將斷乳仔豬應(yīng)轉(zhuǎn)移至無(wú)污染的地點(diǎn)隔離飼養(yǎng)，及時(shí)處理被感染豬的排泄物等污染物，由于PPV對(duì)外界的理化因素有很強(qiáng)的抵抗力，需要用消毒能力較強(qiáng)的消毒劑對(duì)環(huán)境進(jìn)行消毒，如2%NaOH。

無(wú)該病的養(yǎng)殖場(chǎng)在引種時(shí)應(yīng)嚴(yán)格檢測(cè)，最好堅(jiān)持自繁自養(yǎng)，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，保持飼養(yǎng)環(huán)境的清潔，減少應(yīng)激環(huán)境的刺激，做好防疫措施，可接種滅活疫苗或弱毒疫苗，安全性都較為理想，可以有效防控該病的發(fā)生。