楊 彬,徐智凱,李夢嬌,袁艷梅,宮曉倩,劉煒瑋,孫英杰,宋翠萍,譚 磊,仇旭升,廖 瑛,丁 鏟，王金泉，孟春春

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 閔行 200241；3.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚州 225009)

傳染性支氣管炎(Infectious bronchitis，IB)是由傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)引起的一種急性接觸性的呼吸道疾病，是禽類常見的疾病之一[1-3]。該病毒可以感染各種年齡段和各品種的雞[4]。該病毒主要侵害家禽的呼吸系統(tǒng)，嚴重威脅著養(yǎng)禽業(yè)的發(fā)展[5-7]。

IBV是單股正鏈有囊膜的RNA，其基因組的長度大約27.6 kb[8-10]。該基因組結(jié)構(gòu)為(5′UTR-1a-1b-S-3a-3b-3C/E-M-5a-5b-N-ploy(A)3′UTR)[11-13]。該病毒于1936年首次報道[14]，現(xiàn)已呈世界范圍內(nèi)流行，并進化為多種血清型，QX型是我國當(dāng)前的絕對優(yōu)勢流行株[15-17]。由于IBV基因組龐大，易發(fā)生突變和重組，加之目前大量使用IBV弱毒活疫苗，導(dǎo)致該病毒極易發(fā)生變異和產(chǎn)生新的流行毒株。

有研究報道，IBV的重組不僅發(fā)生在野毒株之間，也可發(fā)生在野毒株與疫苗株之間[18-19]，為進一步研究IBV毒株的遺傳變異情況，本試驗對免疫雞群中分離得到的1株病毒CK/CH/HD/190716進行全基因組測序鑒定與遺傳進化分析，得知此毒株為QX型流行的毒株，利用RDP4等生物學(xué)軟件重組分析發(fā)現(xiàn)其基因1a存在重組現(xiàn)象。本試驗對IBV新型重組病毒株的遺傳進化的研究以及IBV的監(jiān)測與防控有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 樣本采自河北邯鄲某蛋雞養(yǎng)殖場傳染性支氣管疫苗免疫的病死雞肺臟。

1.2 主要試劑 TRIzol Reagent試劑，購自Life公司；反轉(zhuǎn)錄M-MLV Reverse、5×Buffer、dNTP、RNA酶抑制劑以及pMD-19T，均購自TaKaRa公司；DH5α，購自上海昂羽生物技術(shù)有限公司；DNA膠回收試劑盒，購自Magen公司；5′full RACE和3′full RACE試劑盒，均購自北京天恩澤基因科技有限公司。

1.3 病毒的鑒定 對病死雞肺臟進行研磨，反復(fù)凍融3次，接種SPF雞胚(購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司)。收集病毒尿囊液，于-80 ℃的冷凍冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病毒基因組的擴增

1.4.1 病毒基因組RNA的提取 分離株接種于9日齡SPF雞胚，收集雞胚尿囊液，于-80 ℃冷凍冰箱中保存?zhèn)溆?。利用TRIzol法提取病毒基因組RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，放-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 全基因組擴增 根據(jù)GenBank 已發(fā)表的IBV基因，對該毒株設(shè)計23對引物，進行全基因組擴增。依據(jù)設(shè)計引物的Tm的大小，GC的含量，設(shè)置擴增反應(yīng)循環(huán)參數(shù)，16對引物為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min,32個循環(huán)；72 ℃ 10 min。7對引物為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min,共32個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

1.4.3 目的基因克隆 將擴增出的各個基因片段按照膠回收試劑盒說明書進行回收，再將其連接到載體上(pMD-19T)，送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.4.4 5′RACE擴增和3′RACE基因的擴增 按照試劑盒說明書對其PCR擴增，將 PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，從而確定擴增產(chǎn)物。

1.5 序列拼接 使用DNASTAR/Lasergene軟件，將測得序列進行拼接，得到此分離株的基因結(jié)構(gòu)為(5′UTR-1a-1b-S-3a-3b-3C/E-M-5a-5b-N-ploy(A)3′UTR)。

1.6 重組分析 參考GenBank上的基因序列，使用MEGA7軟件將分離到的毒株與50株國內(nèi)外的全基因組的參考毒株進行序列比對，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建進化樹，對毒株進行分型；利用Megalign對QX型各個基因組的核苷酸序列進行同源性比較；運用RDP4科學(xué)軟件分析病毒的全基因組的基因重組情況，采用RDP、GENECONV、BootScan、MaxChi、Chimaera、SiScan、3Seq七種重組分析方法來確定重組事件，為更加明確基因的重組情況，使用Simplot軟件進行重組分析。

2 結(jié)果

2.1 CK/CH/HD/190716病毒對雞胚的致病性檢測 分離株CK/CH/HD/190716接種10日齡的SPF雞胚中，經(jīng)剖檢后，有明顯的“卷縮胚”癥狀，結(jié)果見圖1。

圖1 CK/CH/HD/190716 株致雞胚病變 Fig.1 Embryo lesions caused by CK/CH/HD/190716 strainA:10日齡正常雞胚; B:接種病毒病變雞胚 A: Normal chicken embryo of 10 day age; B: Inoculation of virus-diseased chicken embryo

2.2 CK/CH/HD/190716全基因序列測定以及拼接序列 使用DNASTAR軟件將擴增出病毒的全基因組序列進行拼接和比對，從而確定分離株CK/CH/HD/190716的全基因序列的長度是27 680 bp，結(jié)果見表1。

2.3 CK/CH/HD/190716遺傳進化分析 將分離到的CK/CH/HD/190716毒株與GenBank已發(fā)表的50株IBV毒株進行全基因組同源性比較，繪制全基因組序列系統(tǒng)進化樹，如圖2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離株CK/CH/HD/190716與中國分離株CK/CH/LHLJ/130822親緣關(guān)系近，并且此毒株與17個國內(nèi)的分離株、1個國外的分離株形成第1大分支QX基因型。

表1 CK/CH/HD/190716推測的ORFTable 1 Speculative ORF of CK/CH/HD/190716

2.4 CH/HD/190716毒株的同源型分析 根據(jù)全基因進化樹分析，發(fā)現(xiàn)此毒株屬于QX基因型IBV且親緣關(guān)系較近，推測分離株CK/CH/HD/190716在進化過程中可能發(fā)生重組。將CK/CH/HD/190716毒株IBV全基因以及各個基因組序列與GenBank上已公布的我國QX型毒株的各個基因組序列進行同源性比較。發(fā)現(xiàn)QX型IBV這一分支各毒株之間的同源性極高，大約在93%～97%，在5a基因、S基因、N基因存在著明顯差異，結(jié)果如表2。

表2 CH/CH/HD/190716全基因組與參考序列同源性比較Table 2 Comparison of CH/CH/HD/190716 genome-wide and reference sequence homology (%)

2.5 CH/HD/190716毒株的重組分析 通過遺傳進化分析構(gòu)建進化樹發(fā)現(xiàn)，CK/CH/HD/190716毒株與QX型在同一分支，利用RDP4軟件重組分析，發(fā)現(xiàn)1個重組事件,其位置在8 545～9 135 bp，重組概率(P值)分別為GENECONV(2.464×10-25)、MaxChi(1.276×10-12)、Chimaera(3.531×10-13)、SiScan(1.627×10-14)、3Seq(6.217×10-14)，重組來源minor與major親代毒株分別是CK/CH/LJL/140734與SAIBK2，而這2株毒株在GenBank上的登錄序號分別是KX425847和KU317090。用Simplot軟件分析確定兩者的重組位置，得知分離的CK/CH/HD/190716毒株與親本毒株重組的位置在基因1的位置，大約在8 545～9 135 bp，結(jié)果見表3。

表3 CK/CH/HD/190716基因組中重組信息Table 3 Reorganization information in the CK/CH/HD/190716 genome

3 討論

為更好地了解我國QX型IBV流行毒株的遺傳變異情況，本試驗將免疫雞群中分離得到的1株QX型毒株進行了全基因組測序和重組分析，遺傳進化結(jié)果顯示，分離株CK/CH/HD/190716與QX型/IBV同源性都在94%～97%。雖然全基因組水平的同源性差異不顯著，但是各基因之間的同源性有明顯差異。如5a基因的同源性最低只有80.3%，而最高卻高達99.0%；S基因的同源性最低88.2%，而最高的達到97%左右；N基因的同源性最低在87.6%，最高的高達98%左右，而其他基因的同源性大都在90%以上。

近幾年，IBV不斷出現(xiàn)新的變異株，這與病毒的基因突變、插入、缺失和重組等有著密切的聯(lián)系[20-21]。已有文獻報道IBV可借助于RNA聚合酶進行復(fù)制，但由于RNA聚合酶缺乏校正能力，使得IBV易發(fā)生變異和重組[21-22]。有研究報道，IBV的重組不僅發(fā)生在野毒株之間，也可發(fā)生在野毒株與疫苗株之間[18-19]，這與生產(chǎn)上廣泛的使用弱毒疫苗有著一定的聯(lián)系，因此長期使用弱毒疫苗可能會使病毒的致病性增強，導(dǎo)致免疫失敗，從而引起雞群發(fā)病。

由于強毒QX型IBV一直在我國呈常在型流行態(tài)勢，加之IBV容易極易發(fā)生重組，使得QX型IBV的基因組特征呈現(xiàn)出多樣性的趨勢。使用RDP4等多種軟件對CK/CH/HD/190716毒株與QX型進行重組分析，發(fā)現(xiàn)重組片段位置位于基因1，其位置大約在8 545～9 135 bp，已有研究報道，基因1具有2種表達蛋白pp1a和pp1b的復(fù)制酶基因，其復(fù)制酶基因與病毒的復(fù)制和致病性有關(guān)[23-24]。該區(qū)域發(fā)生重組可能會使QX型IBV的致病性呈現(xiàn)更加復(fù)雜的多樣性，導(dǎo)致疫病的流行強度增強從而增加疫情的控制難度,需要對該型病毒的遺傳演化進行密切監(jiān)測。