胡丹，許艷順，姜啟興，夏文水，余達(dá)威

(江南大學(xué) 食品學(xué)院, 江蘇 無錫，214122)

預(yù)制調(diào)理水產(chǎn)品因其食用方便性,迎合大眾快捷消費需求，導(dǎo)致消費增長快速。目前調(diào)制魚制品主要采用凍藏貯運，但淡水魚在凍藏條件下蛋白易冷凍變性、凍后品質(zhì)下降嚴(yán)重，影響消費者的接受性。冷藏保鮮因其在非凍結(jié)條件下進(jìn)行貯藏能夠更好地保持魚肉的新鮮品質(zhì)，但由于微生物和內(nèi)源酶的作用常引起魚肉質(zhì)構(gòu)軟化，保藏期短。如何延長魚肉在冷藏條件下的保質(zhì)期、提升冷鮮魚肉品質(zhì)是目前水產(chǎn)品保鮮研究領(lǐng)域的一個重要方面。目前國內(nèi)外現(xiàn)有研究主要集中在采用生物涂膜或結(jié)合精油等天然產(chǎn)物、超高壓處理等方法來抑制微生物生長，延長產(chǎn)品貨架期，延緩魚片的品質(zhì)劣化[1-3]。目前對于低鹽結(jié)合適度酒腌制對冷鮮魚肉保鮮效果和貯藏過程中品質(zhì)變化的影響還不清楚。

食品調(diào)味配料具有食用安全性高、成本低、應(yīng)用方便等特點，更具生產(chǎn)應(yīng)用價值。鹽腌作為傳統(tǒng)保藏手段在魚類加工保藏中有廣泛的應(yīng)用。QIN等[4]采用低鹽結(jié)合糖腌制對草魚片進(jìn)行保鮮處理，不僅可以延長產(chǎn)品貨架期，還能提升魚片的次黃嘌呤核糖核苷(inosine monophosphate，IMP)含量。白酒是中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品，主要成分為乙醇和水，同時含有一些酯類、高級醇和有機(jī)酸等，常用于肉品烹飪和加工中的調(diào)味處理。盡管體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇，作為消毒劑已廣泛應(yīng)用，但高度酒精處理會給魚肉帶來不同程度的不良風(fēng)味，目前關(guān)于白酒腌制處理對肉品品質(zhì)影響的研究還很少，現(xiàn)有研究也多是研究酒腌制處理對產(chǎn)品感官、風(fēng)味和加工特性的影響方面[5-7]，對于酒腌制對冷鮮魚肉保鮮效果和貯藏過程中品質(zhì)變化的影響還不清楚。

前期研究發(fā)現(xiàn)，低鹽結(jié)合適度白酒腌制能有效抑制冷藏魚肉貯藏過程中腐敗微生物的生長。質(zhì)構(gòu)和滋味是評價魚肉品質(zhì)的重要指標(biāo)，但白酒組合腌制對魚肉貯藏過程中質(zhì)構(gòu)、內(nèi)源蛋白酶活性及滋味品質(zhì)的影響尚不明確。因此，本研究以養(yǎng)殖大宗淡水魚草魚為對象，應(yīng)用常用食品配料食鹽和白酒，以剪切力、微觀組織結(jié)構(gòu)、組織蛋白酶活性、游離氨基酸及IMP含量為指標(biāo)考察低鹽結(jié)合白酒腌制對魚肉冷藏保鮮效果的影響，以期為冷鮮調(diào)理魚制品的開發(fā)與保鮮提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

草魚：2018年10月上旬購于無錫歐尚超市，質(zhì)量為(3.0±0.5) kg/條，體表均勻，鱗片完整有光澤；乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%的白酒(牛欄山)、食鹽，無錫歐尚超市；紋路真空袋，美吉斯。

1.2 儀器與設(shè)備

YMX-958-10L型真空包裝機(jī)，泉州億閩信機(jī)電有限公司；TA-XT2i型物性測試儀，英國Stable Micro System公司；T18 高速分散機(jī)、F-7000 型熒光光譜儀，日本 HITACHI 公司；NIKON ECLIPSE CI型正置光學(xué)顯微鏡，日本尼康NIKON公司；Agilent 1100氨基酸分析儀,美國Agilent公司。

1.3 魚片的腌制處理方法

鮮活草魚剖殺，去頭和內(nèi)臟，沿背鰭線將魚體剖成2片，用碎冰保證低溫，用預(yù)冷自來水沖洗干凈，瀝干后，取背部白色肌肉，切成4 cm×3 cm×2.5 cm的塊狀。然后將魚片隨機(jī)分成3個實驗組(1組為未經(jīng)腌制的F組，另外2組為實驗組分別標(biāo)記為S和 SL組)。S組質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%食鹽腌制9 h后取出洗凈瀝干后真空包裝，SL組質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%食鹽腌制3 h加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的65%vol白酒共同腌制6 h后漂洗瀝干后真空包裝。腌制溫度控制在4 ℃。每6 d取樣進(jìn)行感官評價、剪切力、微觀結(jié)構(gòu)、蛋白酶活性、游離氨基酸以及IMP含量分析。

食鹽和白酒腌制條件的確定是經(jīng)預(yù)實驗以感官評定為指標(biāo)對不同腌制濃度、時間進(jìn)行選擇，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的食鹽腌制3 h后添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的65%vol白酒2段式腌制感官評分較高，魚肉咸淡適中，無不良風(fēng)味。

1.4 分析方法

1.4.1 感官評價

感官評價人員對魚片色澤、氣味和可接受性進(jìn)行評價考察并給出喜好性打分。感官評價分為好、較好、一般、較差和差，對應(yīng)的分值分別是5、4、3、2和1分，魚肉感官評價平均分值≥ 4分為新鮮可接受產(chǎn)品，3～4分為中等可接受產(chǎn)品，<3分則視為腐敗產(chǎn)品。

1.4.2 剪切力及微觀結(jié)構(gòu)的測定

剪切力和微觀結(jié)構(gòu)分別參照賈勝男等[8]、YANG等[9]的方法并加以改進(jìn)，將魚片按橫切面切成2 mm×1 mm×1 mm的薄片，浸入預(yù)冷固定液中(無水乙醇、甲苯、冰乙酸的體積分?jǐn)?shù)分別為60%、30%、10%)，4 ℃固定24 h。取出用體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇脫水1 h，然后用無水乙醇脫水1 h，之后依次放入等體積的乙醇-甲苯混合液中12 h無水甲苯中4 h，最后樣品置于70 ℃蠟液中3 h，使用包埋機(jī)包埋后切成厚度為5 μm薄片，樣品在展片機(jī)中展片，置于載玻片上，于70 ℃烘箱中融蠟1 h，之后依次浸沒于甲苯、無水乙醇、體積分?jǐn)?shù)為50%乙醇、去離子水中各20 min，最后于10 mg/mL曙紅染色2 min，去離子水洗脫2～3 min。干燥后用顯微鏡觀察微觀結(jié)構(gòu)。

1.4.3 蛋白酶活力的測定

1.4.3.1 粗酶液的提取

參照葛黎紅等[10]的方法進(jìn)行提取。

1.4.3.2 組織蛋白酶B、L及Ca激活蛋白酶含量的測定

參照HULTMANN等[11]的方法略加調(diào)整，分別采用Z-Arg-Arg-AMC、Z-Phe-Arg-AMC和N-Succinyl-Leu-Val-Tyr-AMC作為組織蛋白酶B、L及Ca激活蛋白酶的熒光底物，組織蛋白酶B、L狹縫寬度為10 nm，Ca激活蛋白酶的狹縫寬度為5 nm，空白使用100 μL去離子水代替100 μL熒光底物。

1.4.3.3 組織蛋白酶D的測定方法

參照HAGEN等[12]的方法略有修改，1.2 mL 0.2 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液(pH 3.7)及0.4 mL 粗酶液37 ℃預(yù)熱10 min，加入0.4 mL 30 mmol/L酸化牛血紅蛋白在37 ℃下反應(yīng)1 h，加入2 mL 100 mg/mL三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，反應(yīng)終止后混合物于10 000×g下離心10 min，取上清液用lowry法[13]測定其中的肽含量。

1.4.4 游離氨基酸的測定

游離氨基酸的測定參照ZENG等[14]的方法略微修改，準(zhǔn)確稱取5 g樣品，加15 mL 50 g/L的三氯乙酸，均質(zhì)2 min后，用50 g/L的三氯乙酸定容至25 mL容量瓶中，常溫超聲30 min后靜置2 h，取部分上清液用0.22 μm濾膜過濾后，濾液用氨基酸液相自動分析儀測定。

1.4.5 核苷酸降解產(chǎn)物的測定

根據(jù)SUN等[15]的方法略加修改，準(zhǔn)確稱取2 g 碎魚肉，加入7.5 100 g/L的高氯酸溶液，均質(zhì)并離心(10 000×g，10 min，4 ℃)，將沉淀物重復(fù)提取1次，合并上清液，pH調(diào)至6.5～6.8，定容至25 mL，用0.22 μm水系膜過濾后用于高效液相色譜分析。

1.4.6 數(shù)據(jù)處理方法

數(shù)據(jù)處理和分析使用軟件Microsoft Excel 2016和SPSS 19.0，計算平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差及進(jìn)行顯著性分析；數(shù)據(jù)繪圖采用Origin 8.5。

2 結(jié)果與分析

2.1 感官品質(zhì)變化

3組魚片在冷藏期間感官評分變化如圖1所示。貯藏1 d后，F(xiàn)、S和SL組感官值分別為4.7、4.7和5分，結(jié)果表明，低鹽腌制在貯藏第1天，對魚片的感官沒有顯著影響，但適度白酒處理后，魚片的感官分值略有提升。隨著貯藏時間延長，F(xiàn)組的感官評分下降最快，在貯藏第12天時已經(jīng)處于感官腐敗。S組魚片雖然在初期與F組魚片感官接近，但隨著貯藏時間延長，S組直到第18天左右才出現(xiàn)不可接受的腐敗氣味，說明低鹽處理魚片可以在一定程度上抑制魚片的腐敗。SL組在整個貯藏期感官評分一致顯著高于其余2組，真空冷藏第24天感官評分為3.1分，出現(xiàn)輕微不可接受的異味，冷藏30 d后，SL組魚片感官上被認(rèn)為完全腐敗。

圖1 魚片在冷藏期間感官評分變化Fig.1 Changes in sensory scores of fillets during refrigerated storage

2.2 剪切力和微觀結(jié)構(gòu)變化

魚肉含水量高，肉質(zhì)相較畜禽肉更加細(xì)嫩柔軟，剪切力能夠較好反映冷鮮魚肉新鮮度和質(zhì)構(gòu)的變化[16]，由圖2可知，貯藏1 d SL組的剪切力明顯高于S組和F組，這可能與干腌和高濃度的酒精使魚肉適度脫水有關(guān)，但由于S組腌制鹽含量較低，在剪切力上與對照組沒有顯著差異。由圖3微觀組織結(jié)構(gòu)也可以明顯看出，F(xiàn)組的肌纖維截面積大，S組及SL組肌纖維更為緊密，截面積減小，這與THORARINSDOTTIR等[17]研究結(jié)果一致。隨著貯藏時間延長，3組樣品的剪切力均呈現(xiàn)下降趨勢，但SL組下降速度最慢，其次是S組，貯藏18 d后剪切力分別是對照組的1.8(SL組)和1.6倍(S組)，且SL組貯藏至30 d后剪切力仍為F組貯藏18 d后剪切力的1.6倍。結(jié)果表明，腌制處理能顯著延緩魚片的質(zhì)構(gòu)劣化，其中組合腌制的效果比單一鹽腌的效果更佳。由圖3也可明顯看出，貯藏15 d后F組肌原纖維界限不清晰，組織結(jié)構(gòu)松散。而SL組和S組纖維結(jié)構(gòu)保持相對完整和緊密。30 d后F組由于魚肉質(zhì)構(gòu)已完全軟爛，無法進(jìn)行微觀結(jié)構(gòu)觀察，S組的肌原纖維結(jié)構(gòu)已發(fā)生松散崩解，而SL組纖維結(jié)構(gòu)還保持相對完整。結(jié)果表明，2段式組合腌制能夠明顯延緩魚肉冷藏期間纖維崩解和質(zhì)構(gòu)劣化。

圖2 魚片在冷藏期間剪切力的變化Fig.2 Changes in shear force content of fillets during refrigeration

圖3 魚片冷藏期間微觀結(jié)構(gòu)的變化(100×)Fig.3 Changes in microstructure of fillets during refrigeration

2.3 組織蛋白酶B、L、D及Ca激活蛋白酶的變化

對腌制后的3組魚片進(jìn)行組織蛋白酶活性分析，結(jié)果如圖4所示。

α-組織蛋白酶B;b-組織蛋白酶L;c-組織蛋白酶D;d-Ca激活蛋白酶圖4 魚片冷藏期間組織蛋白酶B、組織蛋白酶L、組織蛋白酶D和Ca激活蛋白酶含量的變化Fig.4 Changes of contents of cathepsin B, cathepsin L, cathepsin D and calcium-activated protease of fish fillets during refrigeration

由圖4可知，F(xiàn)組中的組織蛋白酶B和L在貯藏過程中隨著時間延長呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，這與葛黎紅[10]的研究結(jié)果一致。在貯藏12和24 d時，鹽腌處理對組織蛋白酶B有顯著的抑制效果(P<0.05)，而S組與SL組在整個貯藏期幾乎沒有顯著性差異。3組魚肉中的組織蛋白酶L在前6 d幾乎沒有顯著性差異，貯藏6 d后，F(xiàn)組的魚肉組織蛋白酶L的酶活力顯著高于S組和SL組(P<0.05)，而S組的組織蛋白酶L的酶活力顯著高于SL組(P<0.05)。結(jié)果表明,組合腌制處理相比純鹽腌制更能顯著抑制魚肉組織蛋白酶L的酶活力。有研究表明，草魚片在冰藏條件下剪切力與組織蛋白酶B+L顯著相關(guān)[18]。本研究中，組織蛋白酶L的活性在貯藏過程中一直顯著高于組織蛋白酶B(圖4)，雖然組織蛋白酶B和L均具有內(nèi)肽水解活性，對肌原纖維蛋白及其他蛋白質(zhì)具有廣泛的降解作用，但組織蛋白酶L對蛋白質(zhì)的水解貢獻(xiàn)更大[19]，這也能部分解釋S組在貯藏期剪切力低于SL組的原因(圖2)。結(jié)果表明，組合腌制可以顯著抑制由組織蛋白酶B+L引起的魚片軟化作用。貯藏過程中3組魚片中組織蛋白酶D的酶活力變化如圖4-c所示，組織蛋白酶D的酶活性在3組魚片中隨著貯藏時間延長均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，3組魚片在整個貯藏期幾乎沒有顯著性差異，說明鹽腌和酒腌處理對魚肉中組織蛋白酶D沒有明顯影響。Ca激活蛋白酶酶活力隨著貯藏時間延長整體呈下降趨勢，且F組的Ca激活蛋白酶酶活力在第1天時顯著高于S組和SL組。有研究報道，Ca激活蛋白酶可能只在早期參與肌原纖維蛋白的拆卸[20]。貯藏初期SL組和S組的剪切力高于F組可能與抑制Ca激活蛋白酶活性有關(guān)。

魚肉質(zhì)構(gòu)變化與魚體內(nèi)源蛋白酶活性緊密相關(guān)，組合腌制方式可以顯著抑制組織蛋白酶L的活性及初期Ca激活蛋白酶的活性，從而減緩魚肉冷藏期間的質(zhì)構(gòu)軟化。

2.4 游離氨基酸含量的變化

由圖5可知，冷藏期間魚肉中總游離氨基酸含量呈現(xiàn)波動上升的趨勢。貯藏第1天，3組魚片的總游離氨基酸含量沒有顯著差異。隨著貯藏時間延長，F(xiàn)組總游離氨基酸含量顯著低于S組和SL組(P<0.05)。在貯藏第6天時，F(xiàn)組和S組總游離氨基酸含量與第1天相比顯著下降(P<0.05)，游離氨基酸含量下降一方面可能與貯藏過程中魚肉汁液流失有關(guān)，蛋白酶分解魚肉的肌原纖維組織造成魚片的持水力下降；另一方面微生物生長代謝也會利用游離氨基酸及在內(nèi)源脫氨酶和脫羧酶的作用下生成生物胺等物質(zhì)，導(dǎo)致氨基酸含量降低[21]。S組和SL組的總游離氨基酸含量顯著高于F組，可能與抑制微生物生長和汁液流失有關(guān)。綜上表明，組合腌制能減少魚肉冷藏期間游離氨基酸損失。

圖5 三組魚片冷藏期間總游離氨基酸含量的變化Fig.5 Changes of total free amino acid content in three groups of fish fillets during refrigeration

游離氨基酸對品質(zhì)的影響主要體現(xiàn)在滋味的貢獻(xiàn)[23]。因此通過滋味活性值比較，可以更加客觀地反映腌制處理對草魚片冷藏過程中游離氨基酸所貢獻(xiàn)滋味的影響。由圖6可知，鮮味滋味活性值隨著貯藏期延長呈現(xiàn)顯著增加的趨勢，而甜味滋味活性值和苦味滋味活性值在貯藏期各組差異并不明顯。雖然鮮味氨基酸的滋味活性值較低，但谷氨酸與GMP、IMP等組合能產(chǎn)生鮮味協(xié)同作用[24]。由圖6-a可知，貯藏第1天S組和SL組谷氨酸鮮味活性值分別是F組第1天的2.2和1.6倍，貯藏至18 d，谷氨酸鮮味活性值分別是F組的1.64和1.33倍，說明腌制處理可以顯著提高魚片的鮮味滋味。

a-鮮味; b-甜味圖6 魚片冷藏期間鮮味和甜味氨基酸滋味 活性值變化Fig.6 Changes in amino acid activity values of umami and sweet during fish fillet refrigeration

由圖7可知，組氨酸在苦味滋味活性值中貢獻(xiàn)最大，在貯藏期第1天，S組的組氨酸活性值顯著低于F組，SL組與F組之間無顯著性差異，隨著貯藏時間延長，F(xiàn)組的組氨酸含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，且變化范圍大，SL組的組氨酸含量在前18 d一直高于F組和S組，組氨酸可通過細(xì)菌組氨酸脫羧酶轉(zhuǎn)化成組胺[22]，因此，組氨酸的評價還應(yīng)結(jié)合生物胺含量及微生物分析綜合評價。F組組氨酸含量在第6天比第1天下降了約40.1%，相比S組分別和SL組僅下降了約26.8%及25.5%，且在貯藏后期SL組的組氨酸含量一直顯著高于S組。這可能與抑制組胺代謝相關(guān)微生物生長有關(guān)。

圖7 魚片冷藏期間苦味氨基酸滋味活性值變化Fig.7 Changes of bitter amino acid flavor activity of fish fillets during refrigeration

2.5 IMP含量的變化

IMP是肉類產(chǎn)品中重要的呈鮮味物質(zhì)，同時與谷氨酸會產(chǎn)生協(xié)同作用，增加肉品鮮味[25]。魚片冷藏過程中IMP含量變化如圖8所示，隨著貯藏時間的延長，3組魚片中IMP含量均呈現(xiàn)下降趨勢。這與殼聚糖涂膜處理的草魚片IMP含量變化規(guī)律相似[26]。IMP是魚類的主要滋味貢獻(xiàn)物質(zhì)，通常在魚類貯藏早期含量較高，在草魚貯藏6 d內(nèi)IMP含量出現(xiàn)下降[26]。本研究中F組草魚在貯藏1 d后IMP含量為7.14 μmol/g，第6天IMP含量為4.90 μmol/g，較第1天下降了31.4%。S組和SL組較第1天IMP含量分別分別下降了15.8%和14.0%，說明腌制可有效延緩貯藏初期草魚中IMP含量的降解。有研究表明，低鹽結(jié)合低糖及醋和姜汁提取物腌制處理相比對照組均顯著提高草魚肉IMP的含量[4,27]，可能原因是腌制影響了IMP含量相關(guān)酶的活性[28]。F組、S組和SL組IMP含量在第12天時分別較第1天下降了71.1%、65.6%和57.8%，說明IMP的降解主要發(fā)生在魚片貯藏的前12 d，且腌制處理延緩了IMP的降解，同時組合腌制的延緩效果要略優(yōu)于單一的鹽腌制。因此，2種腌制處理對減少魚肉貯藏初期IMP降解有具有積極作用。

圖8 魚片冷藏期間IMP含量的變化Fig.8 Changes of IMP content of fish fillets during refrigeration

3 結(jié)論

通過比較不同腌制處理對草魚片冷藏過程中感官、剪切力、微觀結(jié)構(gòu)、組織蛋白酶活性、游離氨基酸及IMP含量變化的影響研究，得出質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的食鹽結(jié)合質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%的白酒組合腌制在具有較好感官接受性的基礎(chǔ)上，可以通過抑制組織蛋白酶B、L在貯藏后期的活性和Ca激活蛋白酶在貯藏初期的活性有效延緩魚片質(zhì)構(gòu)軟化，較好維持肌纖維的組織結(jié)構(gòu)的完整性，同時與對照組相比可以保留更多的滋味游離氨基酸和延緩IMP的降解，對提升冷藏魚肉質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味具有積極的作用。