顧雅昕，喬柱，郭行，王欣，伊揚(yáng)磊，單媛媛，劉變芳，周元，呂欣

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌，712100)

乳酸菌細(xì)菌素是由乳酸菌通過核糖體合成對同種細(xì)菌(窄譜)或跨屬細(xì)菌(廣譜)有活性的抗菌肽[1]，因其具有安全、無毒和降解無殘留等特點(diǎn)，部分乳酸菌細(xì)菌素已作為食品保鮮劑[2-4]應(yīng)用于食品工業(yè)，并且有潛力作為抗生素替代物[5-6]應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)。但細(xì)菌素由于產(chǎn)量低、提取復(fù)雜和生產(chǎn)成本高等因素制約其商業(yè)化應(yīng)用[7]，近年來，大多數(shù)提高細(xì)菌素產(chǎn)量的研究集中在優(yōu)化培養(yǎng)條件上[8]，而對細(xì)菌素提取方法的選擇少有報(bào)道。

粗提取是細(xì)菌素研究的基礎(chǔ)工作，常見的提取方法有(NH4)2SO4沉淀法、有機(jī)溶劑抽提法、雙水相萃取法、pH吸附解吸法、蒸發(fā)濃縮法、膜分離法和噴霧干燥法等[9-11]。其中(NH4)2SO4沉淀法是目前應(yīng)用最廣泛的粗提細(xì)菌素方法；有機(jī)溶劑抽提法也是常用的提取方式之一，對親脂性蛋白和小分子蛋白有較好的提取效果，根據(jù)細(xì)菌素的特性可選擇極性不同的有機(jī)溶劑，本文選擇極性適中的乙酸乙酯，在不確定細(xì)菌素的性質(zhì)時(shí)較為適用，此外，聯(lián)用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方式能有效去除萃取劑和揮發(fā)性有機(jī)酸，為細(xì)菌素樣品排除部分干擾；除上述2種常用方法外，pH吸附解吸法，又稱菌體吸附法，利用革蘭氏陽性菌在pH環(huán)境改變時(shí)對周邊蛋白質(zhì)吸附能力變化的原理獲取細(xì)菌素，通常認(rèn)為細(xì)菌在pH 6時(shí)對蛋白質(zhì)的吸附能力最強(qiáng)，在pH 2時(shí)吸附能力最弱[12]，因細(xì)菌素不僅存在于發(fā)酵液中，還存在于細(xì)菌自身周圍，這種方法可以防止在獲取發(fā)酵上清液時(shí)對細(xì)菌周圍細(xì)菌素的損失。對于pediocin PA-1[13]、sakacin C2[14]和pentocin MQ1[15]等已知性質(zhì)的細(xì)菌素來說，在進(jìn)行批量化生產(chǎn)時(shí)，可根據(jù)其類別[16]和理化性質(zhì)選擇合適的粗提取方法，從而減少損失和雜質(zhì)干擾，提高得率；對于未知性質(zhì)的細(xì)菌素來說，細(xì)菌素的挖掘成果和產(chǎn)量(指單種細(xì)菌素的產(chǎn)量或多種細(xì)菌素的混合總產(chǎn)量)是衡量提取效率的重要指標(biāo)。以本課題組研究的面包乳桿菌MN047為例，經(jīng)多肽組學(xué)法檢測可產(chǎn)生10多種細(xì)菌素[17]，但傳統(tǒng)的分離純化方式僅能得到1種[18]。隨著Leuconostocpseudomesenteroides607[19]、CarnobacteriummaltaromaticumC2[20]和LactobacillussakeiD98[21]等可產(chǎn)生不止1種細(xì)菌素的菌株陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，考慮某些細(xì)菌素可能因含量少或其他原因在純化過程中被篩除，因此選擇合適的提取方法對提高細(xì)菌素產(chǎn)量和后續(xù)研究至關(guān)重要。

課題組的前期研究中分離到1株可同時(shí)抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的乳桿菌LBM97，經(jīng)16S rDNA鑒定為發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)。本文分別使用(NH4)2SO4沉淀法、乙酸乙酯抽提法和pH吸附解吸法對L.fermentumLBM97進(jìn)行細(xì)菌素提取，優(yōu)化3種方法的提取條件，并對各方法獲得的細(xì)菌素樣品進(jìn)行比較與評價(jià)，選擇合適的提取方法和條件，以期為提高細(xì)菌素得率和全面挖掘L.fermentumLBM97所產(chǎn)細(xì)菌素提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

L.fermentumLBM97分離自陜西省漢中市西鄉(xiāng)縣漿水；指示菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) ATCC25923和大腸桿菌(Escherichiacoli) ATCC25922獲贈于食品科學(xué)與工程楊保偉教授實(shí)驗(yàn)室。

MRS培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖2，蛋白胨1，牛肉膏1，酵母浸粉0.5，醋酸鈉0.5，檸檬酸氫二銨0.2，K2HPO40.2，吐溫-80 0.1，MgSO40.02，MnSO40.005。

LB培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 1，胰蛋白胨1，酵母浸粉0.5。

1.2 儀器與設(shè)備

DRP-9082恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限責(zé)任公司；ST 16R高速冷凍離心，美國Thermo Fisher Scientific公司；SENCO-R旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申生有限公司；IS128實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，上海儀邁儀器科技有限公司；LGJ-10C真空冷凍干燥機(jī)，北京四環(huán)科技儀器廠有限公司；JY04S-3C凝膠成像儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；Victor X3多功能酶標(biāo)儀，珀金埃爾默儀器(上海)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1L.fermentumLBM97的培養(yǎng)時(shí)間

過夜培養(yǎng)的L.fermentumLBM97按照體積分?jǐn)?shù)0.05%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下分別培養(yǎng)48、60和72 h，6 000 r/min離心10 min保留上清液，取200 μL各樣品進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，使用改良的牛津杯雙層瓊脂擴(kuò)散法[22]測定各條件下細(xì)菌素粗樣的抑菌效果，下層為質(zhì)量濃度20 g/L的瓊脂，上層為質(zhì)量濃度8 g/L的LB瓊脂培養(yǎng)基，指示菌為S.aureus和E.coli，培養(yǎng)12 h后觀察結(jié)果。使用凝膠成像儀采集圖片、AutoCAD 2018測量抑菌圈直徑；使用考馬斯亮藍(lán)G-250法和酶標(biāo)儀測定各樣品中的蛋白質(zhì)含量，2項(xiàng)指標(biāo)測定每個樣品重復(fù)3次。

1.3.2 三種方法提取細(xì)菌素及優(yōu)化

按照1.3.1小節(jié)的方法得到發(fā)酵液后，分別使用(NH4)2SO4沉淀法、乙酸乙酯抽提法和pH吸附解吸法提取100 mL發(fā)酵液中的細(xì)菌素。

(NH4)2SO4沉淀法：6 000 r/min離心10 min保留上清液，分次加入充分烘干研磨的(NH4)2SO4細(xì)粉末，使溶液中(NH4)2SO4的溶解度分別達(dá)到60%、70%、80%、90%和100%。待完全溶解后放入4 ℃冰箱過夜充分沉淀，12 000 r/min離心15 min收集沉淀，用蒸餾水溶解沉淀并定容至2 mL，測定粗品蛋白質(zhì)含量并取200 μL進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

乙酸乙酯抽提法：6 000 r/min離心10 min保留上清液，以乙酸乙酯與發(fā)酵液體積比1∶5、2∶5、3∶5、4∶5、5∶5、6∶5和7∶5進(jìn)行萃取，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器對萃取后的乙酸乙酯進(jìn)行蒸發(fā)濃縮，待容器內(nèi)液體完全蒸干后，用蒸餾水溶解沉淀并定容至2 mL，測定粗品蛋白質(zhì)含量并取60 μL進(jìn)行抑菌試驗(yàn)(加樣量為200 μL時(shí)，抑菌圈過大不易測量，為使樣品平行于同一指示菌平板上，故以60 μL為加樣量，pH吸附解吸法亦同)。

pH吸附解吸法：優(yōu)化過程采用3組單因素試驗(yàn)進(jìn)行。70 ℃水浴加熱30 min，以殺死菌體和鈍化酶活力。(1)吸附pH的優(yōu)化：用5 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)菌懸液至pH 5.5～7.0(吸附)，4 ℃靜置90 min，離心(6 000 r/min、20 min、4 ℃)保留菌體。用相同pH的5 mmol/L 磷酸緩沖鹽溶液洗滌菌體2次，將菌體溶于0.1 mol/L 檸檬酸中，再用1 mol/L 檸檬酸調(diào)至適宜的pH 2.0(解吸)，隨后立即離心去除菌體。將上清液用0.2 mol/L的NaHPO4溶液調(diào)節(jié)pH至4.0，進(jìn)行凍干濃縮，最終用pH 6.0的磷酸緩沖鹽溶液將各粗樣定容至2 mL，測定粗品蛋白質(zhì)含量并取60 μL進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。(2)解吸pH的優(yōu)化：吸附pH采用已優(yōu)化的吸附pH，解吸pH為1.6～2.1，其余步驟同上。

1.3.3 細(xì)菌素的抑菌性比較

以各方法中的最優(yōu)條件制備細(xì)菌素樣品，使用牛津杯瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，加樣量為60 μL。記錄抑菌圈直徑并觀察指示菌在培養(yǎng)12、24和36 h時(shí)的變化情況。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)時(shí)間的確定

乳酸菌通常在培養(yǎng)16～20 h進(jìn)入生長穩(wěn)定期[23-25]，在此時(shí)期可產(chǎn)生大量細(xì)菌素、有機(jī)酸和H2O2等代謝產(chǎn)物。為充分獲取此時(shí)期所產(chǎn)的細(xì)菌素，將菌株發(fā)酵至48、60和72 h進(jìn)行抑菌性測定。結(jié)果表明，L.fermentumLBM97對革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的抑制效果不同，對革蘭氏陽性菌的抑菌界線較清晰但抑菌直徑小于革蘭氏陰性菌(圖1)。在不同培養(yǎng)時(shí)間下對2種指示菌的抑菌效果無顯著差異，鄧肯多重比較數(shù)據(jù)顯示在培養(yǎng)60 h時(shí)，對2種指示菌均表現(xiàn)出較好的抑菌效力，對S.aureus和E.coli的平均抑菌直徑分別為14.00和16.40 mm，因此以60 h作為后續(xù)試驗(yàn)的培養(yǎng)時(shí)間。

a-S.aureus;b-E.coli圖1 各培養(yǎng)時(shí)間下發(fā)酵上清液對指示菌的抑制效果Fig.1 Antimicrobial activity of fermentation supernatant on indicator with different culturing time 注：S和E分別表示指示菌類型(下同)；48、60和72分別表示培養(yǎng)時(shí)間

2.2 三種提取方法的優(yōu)化結(jié)果

(NH4)2SO4沉淀法提取的蛋白質(zhì)樣品中，25 ℃下(NH4)2SO4溶解度為80%時(shí)具有最高的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度(4 804.70 μg/mL)和對2種指示菌最強(qiáng)的抑菌活性，對S.aureus和E.coli的平均抑菌直徑分別為13.67和15.20 mm(圖2)，略低于發(fā)酵上清液的抑菌性，考慮到發(fā)酵上清液中還存在有機(jī)酸等其他抑菌物質(zhì)，因此結(jié)果仍具有參考價(jià)值。

圖2 各(NH4)2SO4溶解度下樣品的抑菌圈直徑和蛋白質(zhì)含量Fig.2 Diameters of inhibition zone and protein concentrations of specimens under different solubilities of ammonium sulfate 注：同類字母(ABCD/abcd/αβχδ)用于描述同一指標(biāo)，含不同 字母表示有顯著差異；相同字母表示無顯著差異(下同)

乙酸乙酯抽提法中，提取的樣品蛋白質(zhì)含量隨乙酸乙酯所占體積比的增加而增加。在乙酸乙酯和發(fā)酵上清液體積比(以下簡稱體積比)為1∶5、2∶5和3∶5時(shí)，兩相易發(fā)生乳化現(xiàn)象，樣品中存在蛋白質(zhì)卻無抑菌性；在體積比為4∶5時(shí)，樣品出現(xiàn)抑菌性，并隨體積比的增加而增大，在體積比為7∶5時(shí)，對S.aureus和E.coli的平均抑菌直徑分別為17.00和17.27 mm，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為396.35 μg/mL，表現(xiàn)出最好的抑菌性和最高的蛋白質(zhì)含量(圖3)。此時(shí)的樣品對2種指示菌的抑菌效果與其他樣品均有顯著差異。

圖3 乙酸乙酯與發(fā)酵上清液的不同體積比的樣品抑菌 圈直徑和蛋白質(zhì)含量Fig.3 Diameters of inhibition zone and protein concentrations of specimens under different volume ratios of ethyl acetate and fermented supernatant

圖4 各吸附pH條件下樣品的抑菌圈直徑和蛋白質(zhì)含量Fig.4 Diameters of inhibition zone and protein concentrations of specimens under different adsorption pH

圖5 各解吸pH條件下樣品的抑菌圈直徑和蛋白質(zhì)含量Fig.5 Diameters of inhibition zone and protein concentrations of specimens under different desorption pH

pH吸附解吸法可見在2組優(yōu)化試驗(yàn)的抑菌效果和蛋白質(zhì)含量大致趨勢為先增后降。優(yōu)化吸附pH時(shí)，吸附pH 6.1、解吸pH 2.0的條件下具有最佳抑菌效果和最高的蛋白質(zhì)含量，對S.aureus和E.coli的抑菌圈直徑分別為19.70和16.33 mm，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為514.76 μg/mL；優(yōu)化解吸pH時(shí)，以pH 6.1為吸附pH，測得解吸pH 1.8時(shí)具有最佳抑菌效果和最高的蛋白質(zhì)含量，對S.aureus和E.coli的抑菌圈直徑分別為16.33和16.87 mm，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為543.96 μg/mL。解吸pH優(yōu)化后蛋白質(zhì)含量提高，抑菌圈直徑無明顯變化或減小的原因可能與瓊脂板的厚度和保存時(shí)間差異有關(guān)[26]。

2.3 三種提取方法的比較

以指示菌不生長區(qū)域?yàn)閺?qiáng)抑菌圈，以指示菌濃度明顯低于正常生長濃度區(qū)域?yàn)槿跻志?。S.aureus和E.coli在培養(yǎng)12 h后(圖6-a和圖6-b)，(NH4)2SO4沉淀法得到的細(xì)菌素粗品對2種指示菌均無抑制作用，這與對比試驗(yàn)的加樣量有關(guān)；pH吸附解吸法提取的蛋白質(zhì)樣品對S.aureus有較小的強(qiáng)抑菌圈和較大的弱抑菌圈，而對E.coli僅有較弱的抑菌圈；乙酸乙酯抽提的蛋白質(zhì)樣品對S.aureus表現(xiàn)出較大的強(qiáng)抑菌圈和較小的弱抑菌圈，對E.coli僅有弱抑菌圈。在培養(yǎng)24 h時(shí)觀察到各抑菌圈逐漸縮小(圖未列出)。在培養(yǎng)36 h后(圖6-c和圖6-d)，pH吸附解吸法提取的蛋白質(zhì)樣品所表現(xiàn)出的弱抑菌圈基本消失，對S.aureus的強(qiáng)抑菌圈無明顯變化；乙酸乙酯抽提出的蛋白質(zhì)樣品對S.aureus的抑菌圈逐漸縮小，邊緣也變得模糊不清，對E.coli仍有一定的抑菌效果，但也明顯降低。可見3種方式得到的樣品成分存在差異。

圖6 三種方法提取的細(xì)菌素樣品的抑菌效果比較Fig.6 Antimicrobial activity of bacteriocins isolated using 3 methods 注：第一排為(NH4)2SO4沉淀樣品、第二排左孔為pH吸附解吸 樣品、第二排右孔為乙酸乙酯抽提樣品

菌株的生存環(huán)境和功能影響著細(xì)菌素的產(chǎn)生和性質(zhì)，運(yùn)用不同的提取方法往往有較大的差異。其中(NH4)2SO4沉淀法的操作方式簡單易行，并能提取出最多的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)含量約是另外2種方法的8～15倍，但抑菌效果明顯偏低，推測是(NH4)2SO4對上清液中的蛋白質(zhì)不具選擇性，導(dǎo)致大量雜蛋白析出。并且此方法在提取過程中會沉淀大量色素，影響后續(xù)純化。乙酸乙酯抽提法并不是提取蛋白質(zhì)的專用方法，雖然應(yīng)用于L.fermentumLBM97效果較顯著，但樣品抑菌性會隨著指示菌的培養(yǎng)時(shí)間增加而逐漸失效，可能是細(xì)菌素的穩(wěn)定性低或樣品中的其他抑菌物質(zhì)消耗導(dǎo)致的。此外，乙酸乙酯具有刺激性氣味和低毒性，且本試驗(yàn)中未找到其抽提峰值，若繼續(xù)增加用量可能伴隨試劑的浪費(fèi)和人體的損傷。pH吸附解吸法試驗(yàn)周期略長，在本試驗(yàn)中的平均抑菌直徑也略低于乙酸乙酯抽提法得到的細(xì)菌素樣品，但優(yōu)化試驗(yàn)的最佳條件明顯，提取到的細(xì)菌素穩(wěn)定性高，在指示菌培養(yǎng)36 h時(shí)仍保持良好的抑菌效果，蛋白質(zhì)含量也較高。比較3種提取方法的原理差異，分析此方法提取到的細(xì)菌素大概率被細(xì)菌分泌后保留于菌體周圍，而不是分泌到環(huán)境中，因此增強(qiáng)了細(xì)菌素溶液的抑菌性。

目前研究多是通過優(yōu)化培養(yǎng)基來提高細(xì)菌素產(chǎn)量，選擇合適的提取方法對于提高細(xì)菌素產(chǎn)量、提升細(xì)菌素活性也是至關(guān)重要的。ZIMINA等[27]使用(NH4)2SO4、活性炭和氯仿作為提取劑提取沙福芽孢桿菌B-12180和短小芽孢桿菌B-12182所產(chǎn)的細(xì)菌素，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)18 h后通過(NH4)2SO4沉淀法得到的細(xì)菌素樣品具有較好的抑菌活性，抑菌直徑分別為14～18 mm和10～11 mm。許亦峰等[28]的研究表明，通過(NH4)2SO4沉淀和酸沉淀2種方法對枯草芽孢桿菌FB123細(xì)菌素進(jìn)行粗提，酸沉淀法得到的樣品比活力約為(NH4)2SO4沉淀法的1.5倍。DUNDAR等[29]的研究中提到，對比(NH4)2SO4沉淀法和pH吸附解吸法對糞腸球菌W3細(xì)菌素的提取，發(fā)現(xiàn)2種方法均能提出目的蛋白，pH吸附解吸法得到的樣品活性為原上清液活性的16%，約是(NH4)2SO4沉淀法的4倍。可見不同菌種發(fā)酵液中細(xì)菌素的適宜提取方法存在差異，這可能與細(xì)菌種屬以及存在環(huán)境的差異有關(guān)[30]，也可能與細(xì)菌素本身理化性質(zhì)例如等電點(diǎn)、親疏水性的差異有關(guān)。

3 結(jié)論

本文采用(NH4)2SO4沉淀法、乙酸乙酯抽提法和pH吸附解吸法提取L.fermentumLBM97發(fā)酵60 h的發(fā)酵液中的細(xì)菌素并優(yōu)化提取條件，對比研究發(fā)現(xiàn)pH吸附解吸法提取效果較好，因未能將所有細(xì)菌素的提取方法逐一比較，所以僅能從試驗(yàn)中的3種方法得出pH吸附解吸法為粗提L.fermentumLBM97細(xì)菌素的適宜方法，在吸附pH 6.1、解吸pH 1.8條件下具有較好的抑菌效果和較高的蛋白質(zhì)含量。在考慮樣品間細(xì)菌素存在差異的情況下，將于后期使用肽酶法或組學(xué)法對各樣品進(jìn)行深入研究，以期全面獲取L.fermentumLBM97所產(chǎn)細(xì)菌素。本文為L.fermentumLBM97細(xì)菌素的后續(xù)鑒定、理化性質(zhì)和作用機(jī)制的研究提供原料與數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，為研究者對細(xì)菌素提取方法的選擇提供參考。