張存智，劉晶，張宏，趙建華

(1.寧夏職業(yè)技術學院，銀川 750021；2.寧夏農業(yè)學校，銀川 750021；3.寧夏農林科學院，銀川 750002)

在葡萄釀酒過程中，產生大量的皮渣副產物，約占葡萄加工量的25%～30%。在新鮮紅葡萄皮渣中，含有花色素類、白藜蘆醇、黃酮類、酵母自溶物質等多種有效成分，具有抗氧化、降低血脂膽固醇、軟化血管、抗癌抑癌、美容養(yǎng)顏之功效。目前我國絕大多數的葡萄皮渣得不到有效利用，一般作為飼料、肥料，甚至垃圾處理，資源綜合利用率很低[1-3]。枸杞中富含枸杞多糖、甜菜堿等有效成分，具有提高免疫力、抗衰老、抗腫瘤、保肝等保健作用[4,5]。

果醋被譽為“第四代飲料”，通常是以葡萄、蘋果和桑葚等水果或果品加工的下腳料為主要原料，經酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵釀造而成[6]。徐敏[7]利用葡萄皮渣釀造果醋，李彩霞等[8]利用葡萄和枸杞釀造復合果醋，但以壓榨后常溫保存的新鮮葡萄皮渣和干枸杞微粉復配進行枸杞葡萄醋工藝研究未見報道。液態(tài)固定化法釀造果醋也有報道[9-12]，但以玉米芯為固定化載體進行枸杞葡萄醋工藝研究未見報道。

本研究以室溫保存的新鮮葡萄皮渣和干枸杞微粉為原料，以玉米芯為固定化載體，采用固定化法醋酸液態(tài)發(fā)酵工藝，研究皮渣的新鮮度、枸杞微粉添加量對皮渣酒液和醋液酚類物質含量及醋感官品質的影響，以及不同工業(yè)醋酸菌菌種篩選，為高效利用葡萄皮渣，簡化果醋發(fā)酵工藝提供了理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干枸杞：寧夏山里紅生物科技有限公司中寧特級枸杞。

葡萄皮渣1：2017年，玉泉營“美樂”葡萄正常發(fā)酵，殘?zhí)? g/L，螺旋壓榨，干重為33.8%(100 g的皮渣在40 ℃下烘干3 h后的重量)。

葡萄皮渣2：2017年，玉泉營“美樂”∶玫瑰香為3∶1，葡萄正常發(fā)酵，留糖53 g/L，用氣囊壓榨機壓榨，壓力為0.4個大氣壓，皮渣放置2 d后，干重為24.66%。

活性醋酸菌：濟寧玉園生物科技有限公司活性醋酸菌。本品以AS1.41、滬釀1.01為原種，混合液體培養(yǎng)，真空濃縮，吸附干燥而成。

果醋菌：煙臺帝伯仕自釀機有限公司。

主要試劑：無水碳酸鈉、F-C試劑(福林酚)、2-辛醇等分析純試劑；Biosystem花青素、多酚等試劑盒；蘆丁標準試劑。

輔料：白砂糖，市售；無菌潔凈曬干玉米芯。

1.2 儀器與設備

722S可見分光光度計 上海精密儀器儀表有限公司；普析TU-1901雙光率紫外可見分光光度計；Y15葡萄酒快速分析儀 西班牙Biosystem公司；粉碎粒度可調的粉碎機；8 L玻璃瓶。

1.3 方法

1.3.1 葡萄皮渣酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵方法

醋酸菌、果醋菌活化方法：按重量比1∶10的比例將菌接種待醋酸發(fā)酵的酒液中,搖床培養(yǎng)30 min，轉速120 r/min,溫度在25～35 ℃。

皮渣酒精發(fā)酵：皮渣2在密封罐中存放4，6，8，10 d，加糖，使葡萄醪的比重在1050～1055，加入破碎的枸杞，進行酒精發(fā)酵，結束后的酒精度在6.5% 左右。

皮渣酒精發(fā)酵結束后，皮渣分離，酒液加入到玻璃瓶中，瓶中裝好滅菌的玉米芯，酒液高度以剛好浸沒玉米芯為宜，然后分別加入活化的果醋菌和醋酸菌進行醋酸發(fā)酵，接種量10%。循環(huán)噴淋，循環(huán)量0.5 L/min，發(fā)酵溫度為28～35 ℃，發(fā)酵3 d后，測總酸的變化情況，檢測醋酸發(fā)酵進程。當總酸不再上升或者開始下降時，發(fā)酵時間為15～20 d，加入0.4 g/L的食鹽，防止醋酸氧化，對容器進行封口處理，滿罐貯存。

1.3.2 枸杞不同粉碎粒度的影響

將枸杞利用粉碎粒度可調的粉碎機進行粉碎，分別過50，100，200目的篩網，篩選枸杞不同粉碎粒度對試驗難易程度的影響。

1.3.3 葡萄皮渣不同新鮮度對酒中和醋中酚類物質含量的影響

將皮渣1放置于30 L不銹鋼罐中，封閉保存，分別取在罐中放置不同時間2，4，6，8，10 d的皮渣，酒精發(fā)酵后，檢測葡萄皮渣不同新鮮度對酒中和醋中酚類物質含量的影響。

將皮渣2放置于30 L不銹鋼罐中封存，在6，8，10 d后啟動酒精及醋酸發(fā)酵，菌種為果醋菌，檢測葡萄皮渣不同新鮮度對醋中酚類物質含量的影響。

1.3.4 枸杞不同添加量對醋感官質量和多糖、黃酮含量的影響

取破碎50目的枸杞2，4，6 g/L和0，2，3，4 g/L兩組，分別加入11倍的去離子水，加入果膠酶20 mg/L，在(41±3) ℃水浴中水浴處理3 h后，加入到存放4 d的皮渣2中，在玻璃瓶中進行酒精和醋酸發(fā)酵。2，4，6 g/L處理,醋酸發(fā)酵結束7 d后進行感官分析。0，2，3，4 g/L處理，發(fā)酵結束后30 d后進行醋酸多糖和黃酮含量的檢測。

1.3.5 不同菌種對感官質量的影響

存放8 d的皮渣2，加入50目過篩枸杞4 g/L，酒精發(fā)酵結束后，分別加入果醋菌和醋酸菌進行醋酸發(fā)酵，發(fā)酵結束7 d進行感官質量分析；存放30 d后，檢測總酸、L-蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、乳酸在添加不同醋酸菌的果醋中的含量。

1.3.6 檢測方法

L-總糖、總酸、酒精度、pH采用GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進行測定。

M-蘋果酸、乳酸、檸檬酸、總糖、多酚、花色苷、單寧、花青素、總糖透光率的測定：采用分光光度法。

N-感官指標檢測：10人品鑒小組(都具有品鑒經驗)。

2 結果分析

2.1 枸杞不同粉碎粒度對試驗難易程度的影響

枸杞含有糖和果膠，當枸杞的粉碎粒度為200目時，枸杞容易發(fā)粘，呈塊狀，難以均勻分離。枸杞粉碎到100目時，果肉粉碎了，但是枸杞籽不易粉碎；過篩時，容易將果肉和枸杞籽分離，造成浪費。粉碎成50目過篩，破碎的果肉和枸杞籽都可以通過篩孔。因此，枸杞的粉碎粒度以50目為宜。

2.2 葡萄皮渣不同新鮮度對酒中和醋中酚類物質含量的影響

2.2.1 葡萄皮渣1不同新鮮度對葡萄酒中花色苷和單寧含量的影響

圖1 葡萄皮渣不同新鮮度對葡萄酒中花色苷和單寧含量的影響Fig.1 Effect of different degrees of freshness of grape peel residues on the content of anthocyanins and tannins in red wine

由圖1可知，皮渣壓榨后，存放2，4，6，8，10 d，皮渣酒精發(fā)酵后得到的葡萄酒中，花色苷和單寧在2 d時最高，達到572.67 mg/L和1778.57 mg/L，之后隨著貯藏天數增多，花色苷從572.67 mg/L降低到6 d的138.58 mg/L,降低了75.8%；單寧從1778.57 mg/L降低到6 d的464.29 mg/L，降低了74.9%；兩者均在6 d后速度減慢，10 d后單寧含量僅是2 d的16.5%；花色苷是10.2%。所以，當葡萄酒發(fā)酵結束、皮渣分離后，盡快進行葡萄酒醋的加工，皮渣放置的時間越長，有效成分損失的越多。

2.2.2 葡萄皮渣2不同新鮮度對醋中花青素、多酚和黃酮含量的影響

圖2 葡萄皮渣不同新鮮度對醋中花青素、多酚、黃酮含量的影響Fig.2 Effect of different degrees of freshness of of grape peel residues on the content of anthocyanins, polyphenols and flavonoids in vinegar

由圖2可知，葡萄皮渣2存放的時間越長，果醋菌釀成果醋花青素、多酚、黃酮含量逐漸降低，8 d后降低至接近最低，花青素含量由6 d的23 mg/L下降到4 mg/L，下降了82.6%，多酚含量由6 d的1320 mg/L下降到420 mg/L，下降了68.1%，黃酮含量由6 d的1.54 mg/L下降到0.33 mg/L，下降了78.6%。醋中酚類物質含量的降低與皮渣酒中結果一致。

2.3 枸杞不同添加量對醋感官質量和多糖、黃酮含量的影響

2.3.1 枸杞不同添加量對醋感官質量的影響

由表1可知，隨著枸杞添加量的增加，醋的顏色變淺，有可能是枸杞中黃酮和類胡蘿卜素影響醋的顏色。加入枸杞6 g/L的醋在口感、香氣上欠佳；加入枸杞2 g/L的醋香氣好，香氣優(yōu)雅，令人愉悅，但口感不如4 g/L飽滿和協(xié)調，加入4 g/L為最適宜配方。

2.3.2 枸杞不同添加量對醋多糖和黃酮含量的影響

圖3 不同枸杞添加量對醋多糖、黃酮含量的影響Fig.3 Effect of different additive amount of wolfberry on the content of polysaccharides and flavonoids in vinegar

由圖3可知，隨著枸杞量的增加，黃酮含量和多糖含量都在遞增，由對照0.82，9.57 mg/L，遞增到4 g/L的2.02，13.08 mg/L，分別遞增了2.46倍和1.37倍。由表1可知，枸杞添加量為4 g/L時，感官分析最佳。多糖具有抗腫瘤、增強人體免疫力、降血糖、抗衰老的作用，黃酮具有降血脂、抑制血栓、降血壓、雌性激素(異黃酮)以及抗病毒、抑菌、消炎、保肝等功效，從保健作用、感官質量方面綜合分析，4 g/L枸杞添加量是最佳選擇。

2.4 不同醋酸菌種對醋質量的影響

2.4.1 不同醋酸菌對醋感官品質的影響

存放8 d的皮渣2，加入50目過篩枸杞4 g/L酒精發(fā)酵結束后，酒精度為7.23%(V/V)，分別加入果醋菌和醋酸菌進行醋酸發(fā)酵，發(fā)酵結束7 d進行感官質量分析，品鑒結果見表2。

表2 不同菌種的醋感官分析Table 2 Sensory analysis of vinegar with different bacteria

由表2可知，不同菌種發(fā)酵醋的感官質量不同。果醋菌有花香和水果的清香，入口有甜感，刺激性強，酸較柔，回味長，有甜感；醋酸菌具有糧食醋的香氣，香氣、口感更加濃烈和尖酸。綜合評價，果醋菌的醋適宜做醋飲，醋酸菌的醋口感更加厚實，更適宜做調味品。

2.4.2 不同醋酸菌對醋有機酸含量的影響

不同菌種發(fā)酵的果醋密封存放30 d后，檢測總酸、L-蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、乳酸在添加不同醋酸菌的果醋中的含量。測得的總酸含量不同，果醋菌總酸含量是6.15 g/dL，醋酸菌總酸含量為6.52 g/dL，有機酸含量也不同，見圖4。

圖4 不同醋酸菌種有機酸濃度的比較Fig.4 Comparison of organic acid content of different acetic acid bacteria

由圖4可知，兩種發(fā)酵醋中均以檸檬酸為主，含量相同；L-蘋果酸、酒石酸、乳酸3種有機酸的含量，醋酸菌都比果醋菌的高，在感官品鑒中，醋酸菌入口更加尖酸。

3 討論與結論

目前，食醋的生產工藝主要有固態(tài)、液態(tài)發(fā)酵兩大類，對于優(yōu)化固定化菌釀造食醋的工藝參數的研究不多，固定化微生物技術是通過將微生物高度密集地固定在所選載體上，菌體在短時間內快速增殖，增加單位體積中菌體含量和菌液密度，縮短發(fā)酵周期，具有發(fā)酵效率高、穩(wěn)定性好、易于實現生產自動化、連續(xù)化、菌體可重復利用等優(yōu)點。通過前期的預備試驗，本研究直接將工業(yè)醋酸菌用酒液活化，省去菌種在培養(yǎng)基上的擴大培養(yǎng)，以玉米芯為固定化劑，采用噴淋循環(huán)通氧，該技術應用在葡萄果醋發(fā)酵工藝研究中還未見報道。本研究用皮渣2+糖+枸杞微粉釀造的皮渣酒酒精度為7.23%，不同醋酸菌釀造的醋總酸不同，果醋菌總酸含量是6.15 g/dL，醋酸菌總酸含量為6.52 g/dL，并且有機酸含量也不同，醋酸菌的蘋果酸、酒石酸、乳酸含量要高于果醋菌。

試驗發(fā)現，隨著保存時間的延長，壓榨后葡萄皮渣中花色苷、單寧含量迅速降低，這與龐志申[13]的研究結果一致，38 ℃儲存10 d時，花色苷降解一半。本研究發(fā)現葡萄皮渣密封保存6 d的皮渣，酒中單寧和花色苷相比密封保存2 d的分別下降了74.9%和75.8%；10 d后單寧含量僅是2 d的16.5%；花色苷是10.2%。在醋中，黃酮、花青素和多酚的含量下降程度也得出同樣的結論。分析原因是葡萄皮渣在壓榨過程中，溶解大量的氧氣，謝程程[14]研究發(fā)現氧化劑可直接親核進攻花色苷的C位使花色苷開環(huán)生成查耳酮，查耳酮進一步降解生成各種無色的酯類物質和香蘭素的衍生物。郭耀東[15]研究發(fā)現隨著溫度的升高，葡萄皮花色苷降解速度加快，在光照條件下，花色苷降解速率加快。因此，葡萄皮渣壓榨最好用具有氮氣保護的氣囊壓榨機壓榨，最好低溫、避光、密封保存，并且壓榨后的皮渣應盡快處理，不易保存時間過長。

枸杞粉碎目數以50目最佳，枸杞的添加量不是越多越好，枸杞添加量4 g/L為宜。不同醋酸菌對醋的口感和香氣有顯著的影響，有機酸含量不同，果醋菌更利于生產果醋飲料，醋酸菌更適宜于生產調味品醋。