李霞，胡楠，陳齊琳，王一，李水珍，徐思建，崔萌佳，李靜*

(1.桂林理工大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 桂林 541006；2.桂林萬禾農(nóng)產(chǎn)品有限公司，廣西 桂林 541006)

西番蓮是西番蓮科(Passifloraceae)西番蓮屬(Passiflora)草質(zhì)藤本植物的果實，又稱百香果、雞蛋果、巴西果，是一種芳香可口的水果，有“果汁之王”的美譽，有紫、黃兩種品種[1]。西番蓮富含人體所需的17種氨基酸、β-類胡蘿卜素、多種維生素以及各種微量元素[2]。西番蓮葉可入藥，性溫，無毒，歸肺經(jīng)，有鎮(zhèn)咳、消炎、鎮(zhèn)痛等功效和抗氧化、抗炎、抗菌、降血糖、降血脂等作用[3-8]。

常用的多糖提取方法有熱水提取、酸堿提取、酶提取、超聲波提取、微波提取等[9,10]，其中微波法具有縮短提取時間、降低能耗等特點[11]。響應(yīng)面法(RSM)是一種有效的統(tǒng)計方法，近年來已成功用于開發(fā)、改進(jìn)和優(yōu)化生化過程。與其他方法相比，它可以更有效、更合理地安排和解釋試驗[12,13]。目前已經(jīng)報道的有西番蓮果皮多糖的提取以及西番蓮葉黃酮類物質(zhì)的提取[14,15]，而對西番蓮葉多糖的提取尚未見報道。本文采用微波輔助提取西番蓮葉多糖，考察料液比、提取功率、提取時間對多糖提取率的影響，用響應(yīng)面優(yōu)化其提取工藝，研究其體外抗氧化活性，為進(jìn)一步資源化利用西番蓮提供了理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西番蓮葉(PassifloraedulisSims leaf)：產(chǎn)自桂林，由桂林萬禾農(nóng)產(chǎn)品有限公司提供；95%乙醇；苯酚；硫酸；無水乙醇；水楊酸；硫酸亞鐵；三羥甲基氨基甲烷；鄰苯三酚；三氯乙酸；H2O2；抗壞血酸；DPPH；K3Fe(CN)6；磷酸二氫鈉；磷酸氫二鈉；TCA(三氯乙酸)；FeCl3。

TU-1901型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器公司；ZY-GQ105型離心機 上海紫裕生物科技有限公司；FD-ICE型冷凍干燥機 北京德天佑科技發(fā)展有限公司；DW900型微波爐 天津樂金電子電器有限公司；烘箱；水浴鍋；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；電子天平。

1.2 方法

1.2.1 微波提取

取西番蓮葉5 g，加入100 mL蒸餾水，在420 W下微波提取3 min，抽濾，濾液在4000 r/min下離心15 min，取上清液濃縮，加入4倍無水乙醇，于4 ℃下靜置48 h，4000 r/min下離心15 min，取沉淀進(jìn)行冷凍干燥，得到西番蓮葉粗多糖(water extracted polysaccharide fromPassifloraedulisleaf，WPEL)。

1.2.2 多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法測定多糖含量。準(zhǔn)確量取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL葡萄糖溶液于試管中，定容至1 mL，加入0.5 mL 6%苯酚溶液和2.5 mL濃硫酸，混勻，反應(yīng)20 min。精確量取蒸餾水1 mL，操作步驟同上，作為空白對照組，用紫外-可見分光光度計，于490 nm處測量吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

取1 mL待測樣品溶液于試管中，采用苯酚-硫酸法測定其多糖含量。

1.2.3 單因素分析

研究料液比、微波功率以及提取時間對WPEL提取率的影響。按照1.2.1的提取工藝，設(shè)置微波功率420 W，提取時間3 min，考察不同料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 (g/mL)對WPEL提取率的影響；設(shè)置料液比1∶20 (g/mL)，提取時間3 min，考察不同微波功率350，420，490，560，630 W對WPEL提取率的影響；設(shè)置料液比1∶20 (g/mL)，微波功率420 W，考察不同提取時間1，2，3，4，5 min對WPEL提取率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果設(shè)計因素水平表，以料液比(A)、微波功率(B)和提取時間(C)為自變量，多糖提取量為響應(yīng)值進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析。采用響應(yīng)面優(yōu)化多糖提取工藝，試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 試驗因素水平Table 1 The factors and levels of test

1.2.5 西番蓮葉多糖體外抗氧化活性的測定

通過測定多糖樣品的DPPH自由基清除率、還原能力、羥基自由基清除率及超氧陰離子自由基清除率來評價其體外抗氧化活性[16,17]。

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力的測定

取2.0 mL待測液，加入2 mL 0.04 mg/mL DPPH溶液(以乙醇為溶劑)，混勻后避光反應(yīng)0.5 h，在517 nm處測定其吸光值A(chǔ)i；同時測定乙醇(2.0 mL)和DPPH(2.0 mL)的吸光值A(chǔ)c，乙醇(2.0 mL)和待測液(2.0 mL)的吸光值A(chǔ)j，以Vc作為陽性對照。DPPH自由基清除率計算公式：K=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100%。

1.2.5.2 還原性能力的測定

取0.5 mL待測液，加入0.5 mL 1% K3Fe(CN)6溶液與0.5 mL PBS溶液(0.2 mo1/L，pH為6.7)，于50 ℃反應(yīng)20 min后立即冷卻，加入0.5 mL 10% TCA溶液、0.5 mL 0.1% FeCl3溶液和2.0 mL去離子水，搖勻，靜置10 min，于700 nm下測定其吸光度值A(chǔ)，以Vc作為陽性對照。

1.2.5.3 羥基自由基清除率的測定

取9 mmol/L FeSO4與9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液各1 mL，搖勻后加入1 mL多糖溶液，加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液啟動反應(yīng)，于37 ℃水浴30 min，冷卻至室溫，在510 nm下測吸光度A2。在其他條件不變時；用蒸餾水代替多糖做空白對照A1，以Vc替換多糖作為陽性對照，以蒸餾水替換H2O2溶液測定多糖本底液吸光度A3。羥基自由基清除率計算公式：K=[1-(A1-A2)/A3]×100%。

1.2.5.4 超氧陰離子自由基清除率的測定

取4.5 mL Tris-HCl溶液(50 mmol/L，pH為8.2)于試管中，于25 ℃預(yù)熱20 min，依次加入同樣預(yù)熱條件下的鄰苯三酚溶液(25 mmo1/L)0.3 mL和0.2 mL樣品，并迅速混勻倒入比色皿中，在319 nm處測定吸光度At，每30 s測1次，測定8次，以去離子水作為空白對照，計算鄰苯三酚的氧化速率V0，以At為縱坐標(biāo)，時間為橫坐標(biāo)作圖，計算斜率Vt，以Vc作為陽性對照。超氧陰離子自由基清除率計算公式：Y=(1-Vt/V0)×100%。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

圖1 單因素試驗圖Fig.1 Single factor test

注:A為料液比；B為微波功率；C為提取時間。

由圖1中A可知，多糖提取率隨料液比增大先增大后減小，隨著料液比的增加，處于植物內(nèi)部的細(xì)胞與料液比形成的濃度差越來越大，因此驅(qū)使傳送多糖的動力越大，多糖提取率越高。當(dāng)料液比為1∶20時提取率最大，為10.70%，之后多糖提取率隨料液比增大而有所下降，說明濃度差太大可能導(dǎo)致多糖傳送的效率降低。

由圖1中B可知微波功率對多糖提取率的影響，隨著微波功率增大,提取率先增大后減小，當(dāng)微波功率為490 W時多糖提取率為10.72%。微波功率的增大能夠提高溶劑溫度從而達(dá)到提升多糖提取率的效果；當(dāng)功率超過490 W后，提取率降低，可能是微波功率過高會降解多糖，從而導(dǎo)致多糖提取率下降。

由圖1中C可知，多糖提取率隨著提取時間的增大先增大后減小，當(dāng)時間大于3 min時，提取率下降，在一定時間內(nèi)微波有利于細(xì)胞膜的破碎而使溶出物增多，但若時間過長時，會使多糖分子鏈在高溫時發(fā)生斷裂。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計的試驗結(jié)果和方差分析見表2和表3。將試驗值擬合為二階多項式模型，多糖提取率Y與料液比(A)、微波功率(B)及提取時間(C)的二次方程為：

Y=11.21+0.060A+0.064B-0.016C+0.012AB-0.093AC-0.015BC-0.73A2-0.53B2-0.58C2。

表2 RSM試驗設(shè)計結(jié)果Table 2 Experiment design and results of RSM

表3 RSM回歸模型方差分析結(jié)果Table 3 Regression model variance analysis results of RSM

由表3可知，模型 P<0.0001，表明回歸模型顯著；失擬項P=0.0719>0.05，不顯著；回歸方程模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9890，表明該方程有較好的估計預(yù)測能力，試驗擬合的二階多項式模型是有價值的[18]。試驗值與預(yù)測值之間的相關(guān)性在圖2B中顯示了與對角線的低偏差。

圖2 基于WPEL提取率的殘差圖(A)及試驗值與預(yù)測值對應(yīng)關(guān)系(B)Fig.2 Residual plot based on WPEL extraction rate (A) and the corresponding relation between actual values and predicted values (B)

很高的F值(70.50)與非常低的P值(P<0.0001)證實了數(shù)學(xué)模型的顯著性。通過觀察擬合的殘差值(見圖2中A)，表示殘差的隨機正態(tài)分布圖，其值分布呈隨機正態(tài)分布且分散無規(guī)律，表明模型具有很好的擬合能力。

圖3 微波功率與料液比、提取時間的交互作用Fig.3 Interaction of microwave power with solid-liquid ratio and extraction time

由表3 中P值和F值可知料液比(A)、微波功率(B)及提取時間(C)中對試驗影響較大的是微波功率，因此分析了微波功率與其他因素之間的交互作用。每對交互曲線必須大致平行且具有相同的趨勢以驗證模型的準(zhǔn)確性。由圖3可知，在料液比為1∶10和1∶30的條件下，微波功率對多糖提取率的影響沒有交互作用；在提取時間為2 min和4 min的情況下，多糖的提取率存在相同軌跡，這些結(jié)果均表明參數(shù)之間不存在相互作用。

2.2.2 驗證試驗

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果得到WPEL提取的最佳條件為：料液比1∶20.43 (g/mL)，提取功率494.3 W，提取時間2.98 min，多糖的提取率為11.21%?？紤]到試驗的可行性，取料液比1∶20 (g/mL)，提取功率495 W，提取時間3 min，在此條件下平行3次驗證試驗，多糖提取率為11.24%±0.50%，且提取率相對偏差較小，工藝條件穩(wěn)定。

2.3 體外抗氧化活性的測定

2.3.1 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基是一種用來對抗氧化成分的體外抗氧化性進(jìn)行評價的穩(wěn)定的自由基，清除率越大表明其抗氧化能力越強[19]。不同濃度的WPEL的DPPH·清除能力見圖4中A，Vc對DPPH·的清除先增加而后趨于平穩(wěn)(均在94.9%以上)，WPEL對DPPH·的清除作用在濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)一定劑量效應(yīng)，且隨著濃度的增大而提高，當(dāng)濃度達(dá)到1.0 mg/mL時， DPPH·的清除率為88.79%。

2.3.2 還原能力

由圖4中B可知，Vc和WPEL的還原性能力在濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)一定劑量效應(yīng)，且隨著濃度的增大而提高，當(dāng)濃度達(dá)到1.0 mg/mL時，Vc和西番蓮葉多糖的還原能力分別為3.46和0.567。

2.3.3 羥基自由基清除率

羥自由基是一種強氧化劑，其清除率是物質(zhì)抗氧化作用的重要指標(biāo)[20]。由圖4中C可知，隨著濃度的增大，Vc和WPEL對·OH的清除能力提高，當(dāng)濃度達(dá)到1.0 mg/mL時，Vc和WPEL的清除率分別為98.78%、42.58%。

2.3.4 超氧陰離子自由基清除能力測定

不同濃度的Vc和WPEL超氧陰離子自由基清除能力的測定見圖4中D，在濃度在0.1～1 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，Vc和WPEL的清除率隨濃度的增大而增大，當(dāng)濃度達(dá)到1.0 mg/mL時，Vc和西番蓮葉多糖的超氧陰離子自由基清除能力分別為65.19%和12.31%。

圖4 西番蓮葉多糖的抗氧化活性Fig.4 The antioxidant activities of WPEL

3 結(jié)論

通過考察料液比、提取功率和提取時間對WPEL提取率的影響，并用Box-Behnken進(jìn)行工藝優(yōu)化，最佳提取工藝為：料液比1∶20 (g/mL)，提取功率495 W，提取時間3 min，在此條件下多糖提取率為11.24%±0.50%。體外抗氧化試驗表明WPEL在一定濃度范圍內(nèi)具有抗氧化活性，且隨濃度的增大而增大。當(dāng)WPEL的濃度為1.0 mg/mL時，DPPH·清除率、還原能力、·OH清除率以及超氧陰離子自由基清除率分別為88.79%、0.567、42.58%和12.31%，其中WPEL對DPPH自由基的清除率最為明顯，因此西番蓮葉可以作為一種天然抗氧化劑資源而加以利用。