姚文超 ，李夢醒 ，劉 箐 ，童明月 ，何 鵬 ，唐 巍 *

1 安徽中醫(yī)藥大學體育部，安徽 合肥 230012；

2 安徽中醫(yī)藥大學針灸推拿學院（康復醫(yī)學院），安徽 合肥 230012；

3 安徽中醫(yī)藥大學研究生院，安徽 合肥230012

缺血性腦卒中是影響全球健康的主要公共衛(wèi)生問題，我國40～74 歲居民首次腦卒中標化發(fā)病率平均每年增長8.3%［1］。 腦缺血后神經(jīng)功能的恢復一直是學科領域研究熱點。 研究發(fā)現(xiàn)，有效時間內恢復缺血半暗帶區(qū)血供，重建神經(jīng)血管單元可為腦卒中恢復提供新的機會［2］。 本項目組致力于綜合康復手段對腦缺血大鼠神經(jīng)功能改善的研究，觀察到以針刺聯(lián)合豐富康復訓練效果更優(yōu)［3-4］，且在改善神經(jīng)功能方面涉及血管新生相關因子的表達［5-6］，但這些因子如何影響到血管新生的具體環(huán)節(jié)尚未深入研究。 故本實驗在前期研究基礎上，建立右側大腦中動脈缺血（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠模型，擬通過觀察電針聯(lián)合康復訓練（針康療法）在促進腦功能恢復中對血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、腦源性神經(jīng)營 養(yǎng) 因 子 （brain-derived neurotrophic factor，BDNF）及下游轉導通路磷脂酰肌醇-3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）／蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）的影響，深入闡釋針康療法促進腦缺血后血管新生的機制，以期為針康療法應用于治療腦缺血損傷提供實驗參考。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SPF 級雄性 SD 大鼠 81 只，購于安徽省實驗動物中心［許可證號 SCXK（皖）2019_002］，體質量（300±20）g。 實驗大鼠術前 1 周常規(guī)喂養(yǎng)，術前 12 h禁食不禁水。 實驗遵守科技部制定的《關于善待實驗動物的指導性意見》和安徽中醫(yī)藥大學動物使用和管理委員會有關章程。

1.2 實驗試劑

Anti-VEGF、Anti-BDNF（英國 Abcam 公司）；山羊抗小鼠IgG、兔抗山羊IgG FITC 二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司）；小鼠抗大鼠IgG、CD34-PE（ICO115-PE）（Santa Cruz，美國）；Anti-FLK-1、PI3K、phospho-Akt（Ser473）（美國 CST 公司）；總 RNA 提取試劑（trizol TaKaRa 公司）；RT-PCR 技術盒（TaKaRa公司）；PCR Mix（重慶升博生物科技有限公司）。

1.3 主要儀器

雙極電凝器（北京貝林電子有限公司）；H-800透射電鏡、Leica RM2135 切片機、TK-218I 恒溫攤片烤片機、包埋機（德國 Leica）；顯微鏡（日本Nikon）；DP-801 形態(tài)學顯微圖像分析系統(tǒng)（江蘇捷達科技發(fā)展有限公司）；PowerPac 1000 電泳系統(tǒng)、凝膠成像儀（美國Bio-Rad 公司）；華佗牌針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；華佗牌SDZ-V 多功能電針治療儀（江蘇省蘇州華佗醫(yī)療器械有限公司）。

2 實驗方法

2.1 模型制備及分組

將81 只實驗大鼠按隨機數(shù)字表法分為假手術組、模型組和電針聯(lián)合康復訓練組（針康聯(lián)合組），每組 27 只。 參照 Zea Longa 等［7］線栓法建立 MCAO模型。 大鼠經(jīng)異氟烷（誘導濃度4%，維持濃度2%）吸入麻醉后，大鼠頸部正中稍靠右處做一縱行切口，逐層分離皮下組織，暴露頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈，尼龍線從頸外動脈與頸內動脈分叉處起始插入，稍遇阻力即停止，打結、固定。 假手術組僅作頸動脈分離，不插線。

術后待大鼠清醒后，采用改良mNSS18 分制評分標準［8］評估神經(jīng)功能缺損程度，選取評分為2～18 分的大鼠入模型組和針康聯(lián)合組。

2.2 干預方法

選取百會、風府、心俞（左側）和內關（左側）4 個穴位（定位參考《大鼠穴位圖譜的研制》［9］）。 待術后4 h 即予電針治療，皮筋固定大鼠于鼠板，0.30 mm×25 mm 毫針針刺，接電針治療儀。 百會、風府為1 組，心俞、內關為1 組，近心端腧穴接正極，遠心端腧穴接負極。 電針參數(shù)：疏密波，頻率4～20 Hz，輸出電壓 2 V，輸出電流 0.5 mA，1 次／d，時間 20 min，連續(xù)治療14 d。 造模前，將針康聯(lián)合組大鼠置于跑臺進行適應性跑步3 d，速度分別設置12 m／min，時間30 min／d。 術后當日，針康聯(lián)合組給予 5 m／min、30 min／d 跑臺訓練，術后 1～3 d 跑臺速度為 8 m／min，3 d 后調整至 12 m／min。

假手術組和模型組均同等條件抓取、固定，不給予任何治療。

2.3 觀察指標及檢測方法

2.3.1 透射電鏡觀察缺血區(qū)神經(jīng)元超微結構 干預結束后取大鼠，異氟烷吸入麻醉后，斷頭取腦，冰上分離缺血側海馬組織，預冷的生理鹽水充分漂洗，取出吸干后迅速置入避光戊二醛溶液中。 雙蒸水洗2 次，逐級丙酮脫水，浸透、包埋、修塊，超薄切片機切取厚度60 nm，枸櫞酸鉛、醋酸鈾雙重染色，H-800 透射電鏡觀察神經(jīng)元結構并攝片。

2.3.2 免疫組化法和Weidner 法觀察微血管密度（microvessel density，MVD） 同上述麻醉步驟后，0.9%氯化鈉溶液快速灌沖心臟，斷頭、取腦，4%多聚甲醛溶液保存腦組織。 48 h 后取出，行脫水、石蠟包埋、切片（厚約 4 μm）、攤片、烤片等常規(guī)步驟，添加 CD34 一抗、二抗，孵育、顯色、封片。 高倍鏡（×400 倍）觀察，以棕黃色顆粒沉積物為CD34 陽性表達。 鏡下隨機取5 個視野中CD34 陽性細胞的平均值表示微血管密度。

2.3.3 Western blot 法檢測 VEGF、BDNF、PI3K、Akt的相對表達量 同上述麻醉步驟后，斷頭、冰浴下取腦缺血半暗帶組織，加入RIPA 細胞裂解液，研磨后冰上靜置，4 ℃、12 000 r／min 離心 15 min 后提取組織總蛋白質，－80 ℃冰箱保存。 按BCA 蛋白定量試劑盒說明，測定蛋白濃度。以1∶4 比例將5×SDSPAGE 凝膠加入蛋白樣品中，沸水加熱至蛋白充分變性。 SDS-PAGE 電泳分離目的蛋白（120 V，1 h），轉膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h 后，將膜轉移至含有檢測蛋白一抗的封閉液中，4 ℃孵育過夜。 TBST 液洗膜后按一抗標簽加入相應的二抗，室溫孵育2 h，洗膜。 采用ECL 進行顯色，壓片曝光、定影，最終進行條帶分析。 運用Image J 軟件分析目標條帶灰度值，以各目的條帶蛋白與內參蛋白β-actin 表達量比值作為其相對表達量。

2.3.4 RT-PCR 法檢測 VEGF、BDNF、PI3K、Akt mRNA的相對表達水平 取部分上述-80 ℃保存的腦缺血半暗帶組織，采用Trizol 法提取總RNA 后進行反轉錄，將反轉錄出的cDNA 保存于-80 ℃冰箱備用。熒光定量 PCR 測定 VEGF、BDNF、PI3K 及 Akt mRNA的相對表達量。 反應步驟為：95 ℃預變性 1 min，95 ℃變性 5 s，60 ℃退火 10 s，共循環(huán) 40 次。 β-actin為內參基因，按照2-△△Ct法處理、分析數(shù)據(jù)，計算各實驗指標mRNA 的相對表達水平。

2.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析。 計量資料用（）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗，組內前后比較采用配對t 檢驗，采用重復測量方差分析檢驗各指標隨時間的變化情況。 P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結 果

3.1 3 組大鼠各時間點腦缺血區(qū)神經(jīng)元超微結構比較

假手術組神經(jīng)元胞質內細胞器、自噬泡、溶酶體排列清晰，細胞核飽滿、染色質均勻，核膜完整、內外結構清晰。 模型組神經(jīng)元形態(tài)不規(guī)則，細胞空泡樣變，核糖體、自噬泡減少，線粒體腫脹、空泡，細胞核固縮、核膜皺縮間隙增寬，染色質高度聚集，細胞邊界不清。 針康聯(lián)合組各時間點（3、7、14 d）神經(jīng)元胞膜趨向完整，線粒體、粗面內質網(wǎng)、自噬泡分布均勻，仍可見部分萎縮的細胞器，但結構及空泡樣變較模型組有較大改善。 見圖1。

3.2 3 組大鼠各時間點腦缺血區(qū)MVD 計數(shù)比較

以棕黃色CD34 陽性細胞為新生血管標記物。腦缺血區(qū)域MVD 計數(shù)在不同分組間差異具有統(tǒng)計學意義（FIntergroup＝141.762，P＜0.001），不同時間點的變化趨勢差異具有統(tǒng)計學意義（FTime＝81.920，P＜0.001），兩者具有明顯交互作用（FInteraction＝44.960，P＜0.001）。

控制時間因素，進行組間比較，結果顯示，針康聯(lián)合組在 3、7、14 d 時，均高于其他 2 組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明缺血、缺氧環(huán)境啟動內源性機制，誘導缺血半暗區(qū)微血管新生，但鑒于其自身修復能力有限，介入電針聯(lián)合康復訓練可增加新生微血管密度計數(shù)，促進血管再生。 控制分組因素，進行組內各時間點比較，結果顯示，假手術組和模型組各時間點差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），針康聯(lián)合組3 d 與7、14 d 比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。假手術組和模型組改變趨勢為先上升后下降，針康聯(lián)合組為持續(xù)上升趨勢，據(jù)此推斷，無外界干預刺激的情況下，新生微血管增長速度比較緩慢，康復手段的早期介入，可持續(xù)、有效促進缺血損傷后血管新生。 同時，有效時間內治療效果與療程呈正相關性，提示適當延長療程利于腦缺血后的康復。 見圖 2、表 1。

3.3 3 組大鼠各時間點腦缺血區(qū) VEGF、BDNF、PI3K、Akt 蛋白表達比較

大鼠缺血區(qū)腦組織 VEGF、BDNF、PI3K、Akt 蛋白重復測量的方差分析，各變量在不同分組間差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），不同時間點的變化趨勢差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），兩者具有明顯交互作用（P＜0.001）。

控制時間因素，進行組間比較，針康聯(lián)合組在3、7、14 d 時的蛋白表達，均高于其他 2 組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示腦卒中后的缺血、缺氧微環(huán)境，可誘導 VEGF、BDNF、PI3K、Akt 因子的表達，參與腦缺血后神經(jīng)、血管系統(tǒng)重構，針康療法的介入使得機體自行修復效果得以增強。 控制分組因素，進行組內各時間點比較，結果顯示，假手術組各時間點差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；模型組7 d 時VEGF、Akt 蛋白表達增加，與 3、14 d 比較，差異均具有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05）； 模型組 7 d 時 BDNF、PI3K 蛋白表達高于3 d 時，差異均具有統(tǒng)計學意義（P ＜0.01）； 針 康 聯(lián) 合 組 14 d 時 VEGF、BDNF、PI3K、Akt 蛋白表達增加明顯，與 3、7 d 比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。假手術組和模型組呈先上升后下降趨勢，針康聯(lián)合組則持續(xù)攀升，提示在14 d 的療程范圍內，相關因子表達在針康療法作用下，隨治療時間累積。 見圖3 和表2～5。

3.4 3 組大鼠各時間點腦缺血區(qū)VEGF、BDNF、PI3K、Akt mRNA 表達比較

大鼠缺血區(qū)腦組織 VEGF、BDNF、PI3K、Akt mRNA重復測量的方差分析，各變量在不同分組間差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），不同時間點的變化趨勢差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），兩者具有明顯交互作用（P＜0.001）。

控制時間因素，進行組間比較，針康聯(lián)合組在3、7、14 d 時的 mRNA 表達，均高于其他 2 組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。 在控制分組因素方面，進行組內各時間點比較，結果顯示，假手術組3、7、14 d時 VEGF、BDNF、PI3K、Akt mRNA 表達差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；模型組 VEGF mRNA 表達7 d與14 d 時比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；BDNF mRNA 表達 3 d 與 7、14 d 時比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；PI3K mRNA 表達 3 d 與 7 d時比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；針康聯(lián)合組中，VEGF、BDNF mRNA 表達，7 d 與 3、14 d 時比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；PI3K mRNA表達3 d 與7 d 比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。針康聯(lián)合組 7 d 時 VEGF、BDNF、PI3K、Akt mRNA表達增加明顯，與3、14 d 比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；各變量 mRNA 表達組別×時間均有明顯交互作用（P＜0.001）。

以上結果表明，腦缺血后機體通過上調VEGF、BDNF、PI3K、Akt 因子表達，誘導血管新生。 模型組和針康聯(lián)合組均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，于7 d 時表達至峰值，說明在治療7 d 時相關因子表達進入旺盛期， 提示可選擇7 d 作為療效觀察點， 雖然在14 d 時有所衰減，但血管新生因子的表達及作用隨療程延長而持續(xù)發(fā)揮，此與MVD 計數(shù)和相關蛋白表達結果趨同。 見表6～9。

4 討 論

缺血性腦卒中屬中醫(yī)學“中風”范疇，基本病機為臟腑陰陽失調，氣血逆亂，上犯于腦。 腦缺血再灌注后神經(jīng)元水腫、壞死，線粒體、內質網(wǎng)等細胞器結構和功能異常，造成神經(jīng)功能障礙。 本實驗通過透射電鏡發(fā)現(xiàn)，模型組神經(jīng)元多見空泡樣變，線粒體腫脹，細胞核固縮，提示缺血可造成神經(jīng)元結構損傷，模型建立成功。 同時，神經(jīng)元啟動自身修復機制，細胞結構趨于改善，但仍存在一定局限性，電針聯(lián)合康復訓練對缺血區(qū)神經(jīng)元結構改善有積極的促進作用。

表1 3 組各時間點腦缺血區(qū)MVD 計數(shù)比較（）Table 1 Comparison of MVD counts in the cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

注：與假手術組同一時間點比較，1） P＜0.01；與模型組同一時間點比較，2） P＜0.01；與組內 3 d 比較，3） P＜0.01。Note: Compared with the sham operation group at the same time point, 1) P＜0.01; Compared with the model group at the same time point, 2) P＜0.01; Compared with the time point of 3 d in group, 3) P＜0.01.

7 d 7.67±0.58 19.00±1.731）27.33±2.081）2）3）141.762，0.000 81.920，0.000 44.960，0.000組別假手術組模 型 組針康聯(lián)合組干預措施（F 值，P 值）時間（F 值，P 值）交互作用（F 值，P 值）n 3 3 3 3 d 7.33±0.58 16.00±1.001）20.00±1.731）2）14 d 7.00±1.00 17.67±2.081）29.33±1.151）2）3）

表2 3 組各時間點腦缺血區(qū)VEGF 蛋白的表達（）Table 2 Expression of VEGF protein in the cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

表2 3 組各時間點腦缺血區(qū)VEGF 蛋白的表達（）Table 2 Expression of VEGF protein in the cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

注：與假手術組同一時間點比較，1） P＜0.01；與模型組同一時間點比較，2） P＜0.01；與組內 3 d 比較，3） P＜0.01；與組內 7 d比較，4） P＜0.01。Note: Compared with the sham operation group at the same time point, 1) P＜0.01; Compared with the model group at the same time point, 2) P＜0.01; Compared with the time point of 3 d in group, 3) P＜0.01; Compared with the time point of 7 d in group, 4) P＜0.01.

7 d 0.313±0.109 0.625±0.0401）3）1.175±0.0181）2）3）398.772，0.000 100.462，0.000 85.121，0.000組別假手術組模 型 組針康聯(lián)合組干預措施（F 值，P 值）時間（F 值，P 值）交互作用（F 值，P 值）n 3 3 3 3 d 0.290±0.023 0.454±0.0141）0.804±0.0361）2）14 d 0.262±0.035 0.471±0.0341）4）1.391±0.0501）2）3）4）

表3 3 組各時間點腦缺血區(qū)BDNF 蛋白的表達（）Table 3 Expression of BDNF protein in the cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

表3 3 組各時間點腦缺血區(qū)BDNF 蛋白的表達（）Table 3 Expression of BDNF protein in the cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

注：與假手術組同一時間點比較，1） P＜0.01；與模型組同一時間點比較，2） P＜0.01；與組內 3 d 比較，3） P＜0.01，4） P＜0.05；與組內 7 d 比較，5） P＜0.05。Note: Compared with the sham operation group at the same time point, 1) P＜0.01; Compared with the model group at the same time point, 2) P＜0.01; Compared with the time point of 3 d in group, 3) P＜0.01, 4) P＜0.05; Compared with the time point of 7 d in group, 5) P＜0.05.

7 d 0.387±0.032 0.739±0.0121）3）1.155±0.0341）2）4）903.082，0.000 53.714，0.000 41.797，0.000組別假手術組模 型 組針康聯(lián)合組干預措施（F 值，P 值）時間（F 值，P 值）交互作用（F 值，P 值）n 3 3 3 3 d 0.369±0.036 0.523±0.0141）0.927±0.0411）2）14 d 0.360±0.045 0.622±0.0421）1.556±0.1011）2）3）5）

腦卒中發(fā)生后促進血管的生成利于神經(jīng)發(fā)生和功能恢復。 目前，諸多學者對神經(jīng)血管單元相關靶點開展研究［10］，認為促進腦缺血后血管新生，盡快恢復缺血區(qū)的血液供應， 挽救瀕臨死亡的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質細胞和血管內皮細胞，可能成為一種保護缺血腦組織、促進功能恢復的新手段［11-12］。

針刺治療腦卒中療效肯定，多項研究表明電針可促進MCAO 大鼠血管新生相關因子表達［13-14］。病變在腦，首取督脈。 張錫純在《醫(yī)學衷中參西錄》中指出：“神明之體藏于腦，神明之用發(fā)于心”，提出心腦相通的理論，心腦共主神明，心腦疾病可通過心腦同治進行治療［15］。 百會為手足少陽、足太陽、足厥陰與督脈之會，有補神益智、開竅啟閉之功；風府為督脈、足太陽、陽維之會穴，可通督醒腦，調動五臟六腑之精氣；心俞屬足太陽膀胱經(jīng)，為調理“心”臟要穴；內關為八脈交會穴之一，主陰主血，可使心、脈、血及神相互聯(lián)系，具有寧心安神之效。 依據(jù)以上理論， 本研究針刺處方選用督脈經(jīng)穴百會、風府，輔以心俞、內關，電針治療以醒神開竅、調督通絡。 跑臺訓練能促進梗死灶邊緣神經(jīng)血管單元超微結構的修復［16-17］。電針與康復訓練的聯(lián)合應用，是中醫(yī)康復方法與現(xiàn)代康復技術的優(yōu)化結合［18］。 故本實驗采用電針聯(lián)合康復訓練治療腦缺血大鼠，具備“針康同步、整體康復”的優(yōu)勢。 實驗發(fā)現(xiàn)，針康聯(lián)合組細胞膜逐漸趨向完整，多數(shù)細胞器分布均勻、結構較模型組有較大改善，治療14 d 時部分細胞結構趨于完整，損傷程度較其他時間點有所減輕，提示針康聯(lián)合療法可改善梗死區(qū)神經(jīng)元的壞死情況，增強其缺血區(qū)神經(jīng)元的結構恢復，減輕缺血缺氧所致的腦組織損傷，這與劉榮等［19］的研究結果相一致。

表4 3 組各時間點腦缺血區(qū)PI3K 蛋白表達（）Table 4 Expression of PI3K protein in cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

表4 3 組各時間點腦缺血區(qū)PI3K 蛋白表達（）Table 4 Expression of PI3K protein in cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

注：與假手術組同一時間點比較，1） P＜0.01；與模型組同一時間點比較，2） P＜0.01；與組內 3 d 比較，3） P＜0.01，4） P＜0.05；與組內 7 d 比較，5） P＜0.05。Note: Compared with the sham operation group at the same time point, 1) P＜0.01; Compared with the model group at the same time point, 2) P＜0.01; Compared with the time point of 3 d in group, 3) P＜0.01, 4) P＜0.05; Compared with the time point of 7 d in group, 5) P＜0.05.

7 d 0.479±0.007 0.763±0.0061）3）1.410±0.0571）2）4）2 312.264，0.000 106.552，0.000 76.208，0.000組別假手術組模 型 組針康聯(lián)合組干預措施（F 值，P 值）時間（F 值，P 值）交互作用（F 值，P 值）n 3 3 3 3 d 0.445±0.011 0.563±0.0121）1.101±0.0091）2）14 d 0.456±0.024 0.620±0.0691）1.713±0.0351）2）3）5）

表5 3 組各時間點腦缺血區(qū)Akt 蛋白表達（）Table 5 Expression of Akt protein in cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

表5 3 組各時間點腦缺血區(qū)Akt 蛋白表達（）Table 5 Expression of Akt protein in cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

注：與假手術組同一時間點比較，1） P＜0.01，2） P＜0.05；與模型組同一時間點比較，3） P＜0.01；與組內 3 d 比較，4） P＜0.01，5） P＜0.05；與組內 7 d 比較，6） P＜0.05。Note: Compared with the sham operation group at the same time point, 1) P＜0.01, 2) P＜0.05; Compared with the model group at the same time point, 3) P＜0.01; Compared with the time point of 3 d in group, 4) P＜0.01, 5) P＜0.05; Compared with the time point of 7 d in group, 6) P＜0.05.

7 d 0.427±0.021 0.848±0.0131）4）1.555±0.0091）3）4）1 581.880，0.000 75.381，0.000 58.594，0.000組別假手術組模 型 組針康聯(lián)合組干預措施（F 值，P 值）時間（F 值，P 值）交互作用（F 值，P 值）n 3 3 3 3 d 0.411±0.242 0.602±0.0211）1.205±0.0321）3）14 d 0.431±0.031 0.653±0.0472）6）1.922±0.1172）3）5）6）

表6 3 組各時間點腦缺血區(qū)VEGF mRNA 相對表達量（）Table 6 Relative expression of VEGF mRNA in cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

表6 3 組各時間點腦缺血區(qū)VEGF mRNA 相對表達量（）Table 6 Relative expression of VEGF mRNA in cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

注：與假手術組同一時間點比較，1） P＜0.01；與模型組同一時間點比較，2） P＜0.01；與組內 3 d 比較，3） P＜0.01；與組內 7 d比較，4） P＜0.01。Note: Compared with the sham operation group at the same time point, 1) P＜0.01; Compared with the model group at the same time point, 2) P＜0.01; Compared with the time point of 3 d in group, 3) P＜0.01; Compared with the time point of 7 d in group, 4) P＜0.01.

7 d 1.00±0.10 1.52±0.061）3.44±0.121）2）3）445.845，0.000 100.343，0.000 72.631，0.000組別假手術組模 型 組針康聯(lián)合組干預措施（F 值，P 值）時間（F 值，P 值）交互作用（F 值，P 值）n 3 3 3 3 d 1.00±0.09 1.38±0.191）2.28±0.201）2）14 d 1.01±0.13 1.41±0.021）4）2.35±0.161）2）4）

表7 3 組各時間點腦缺血區(qū)BDNF mRNA 相對表達量（）Table 7 Relative expression of BDNF mRNA in cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

表7 3 組各時間點腦缺血區(qū)BDNF mRNA 相對表達量（）Table 7 Relative expression of BDNF mRNA in cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

注：與假手術組同一時間點比較，1） P＜0.05，2） P＜0.01；與模型組同一時間點比較，3） P＜0.01；與組內 3 d 比較，4） P＜0.01，5） P＜0.05；與組內 7 d 比較，6） P＜0.01。Note: Compared with the sham operation group at the same time point, 1) P＜0.05, 2) P＜0.01; Compared with the model group at the same time point, 3) P＜0.01; Compared with the time point of 3 d in group, 4) P＜0.01, 5) P＜0.05; Compared with the time point of 7 d in group, 6) P＜0.01.

7 d 1.00±0.06 1.34±0.062）5）3.00±0.202）3）4）427.743，0.000 13.984，0.000 10.317，0.000組別假手術組模 型 組針康聯(lián)合組干預措施（F 值，P 值）時間（F 值，P 值）交互作用（F 值，P 值）n 3 3 3 3 d 1.00±0.07 1.24±0.021）2.17±0.322）3）14 d 1.01±0.12 1.28±0.021）4）2.36±0.322）3）6）

表8 3 組各時間點腦缺血區(qū)PI3K mRNA 相對表達量（）Table 8 Relative expression of PI3K mRNA in cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

表8 3 組各時間點腦缺血區(qū)PI3K mRNA 相對表達量（）Table 8 Relative expression of PI3K mRNA in cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

注：與假手術組同一時間點比較，1） P＜0.01；與模型組同一時間點比較，2） P＜0.01；與組內 3 d 比較，3） P＜0.01，4） P＜0.05。Note: Compared with the sham operation group at the same time point, 1) P＜0.01; Compared with the model group at the same time point, 2) P＜0.01; Compared with the time point of 3 d in group, 3) P＜0.01, 4) P＜0.05.

7 d 1.01±0.11 1.36±0.071）3）2.94±0.281）2）4）918.388，0.000 9.162，0.003 4.354，0.017組別假手術組模 型 組針康聯(lián)合組干預措施（F 值，P 值）時間（F 值，P 值）交互作用（F 值，P 值）n 3 3 3 3 d 1.01±0.10 1.23±0.051）2.59±0.061）2）14 d 1.01±0.13 1.29±0.051）2.61±0.071）2）

表9 3 組各時間點腦缺血區(qū)Akt mRNA 相對表達量（）Table 9 Relative expression of Akt mRNA in cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

表9 3 組各時間點腦缺血區(qū)Akt mRNA 相對表達量（）Table 9 Relative expression of Akt mRNA in cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

注：與假手術組同一時間點比較，1） P＜0.01；與模型組同一時間點比較，2） P＜0.01；與組內 3 d 比較，3） P＜0.01；與組內 7 d比較，4） P＜0.01。Note: Compared with the sham operation group at the same time point, 1) P＜0.01; Compared with the model group at the same time point, 2) P＜0.01; Compared with the time point of 3 d in group, 3) P＜0.01; Compared with the time point of 7 d in group, 4) P＜0.01.

7 d 1.01±0.15 1.47±0.191）3.32±0.281）2）3）543.814，0.000 32.931，0.000 21.426，0.000組別假手術組模 型 組針康聯(lián)合組干預措施（F 值，P 值）時間（F 值，P 值）交互作用（F 值，P 值）n 3 3 3 3 d 1.00±0.08 1.31±0.061）2.17±0.211）2）14 d 1.00±0.08 1.34±0.091）2.57±0.201）2）4）

前期研究已證實，應用綜合康復方法治療腦缺血，可通過上調血管新生相關因子VEGF、VEGFR2、bFGF的表達，下調血管新生抑制因子ES、TSP-1 表達，促進血管新生；但這些因子在血管新生的具體環(huán)節(jié)中是如何作用，尚未有深入研究。VEGF 聯(lián)系眾多信號通路，在血管新生過程中發(fā)揮無可替代的作用［20］。BDNF 是一種神經(jīng)營養(yǎng)類因子，支持多種神經(jīng)元的存活、分化及生長發(fā)育，同時可誘導內皮細胞血管新生及Akt 的磷酸化，由其介導的血管新生與PI3K／Akt信號通路關系密切。 新血管的形成可通過內皮細胞表面特異性標記物來識別，主要表達于新生血管內皮中的CD34 特異性高，重復性好，用于腦缺血后血管新生的判斷更為可靠。 因此本實驗通過檢測CD34 陽性細胞的表達計算MVD，用于觀察MCAO大鼠缺血區(qū)血管新生情況。

本實驗結果顯示：VEGF、BDNF、PI3K、Akt 蛋白及mRNA 相對表達量和MVD 計數(shù)， 在不同分組間具有明顯統(tǒng)計學意義，說明針康聯(lián)合療法在促血管新生相關因子、CD34 表達方面有明顯優(yōu)勢，可使表達時相前移。 各組不同時間點的變化趨勢差異明顯，以7 d 為重要觀察點，針康聯(lián)合療法的介入使機體在自行修復基礎上，效果得以最大化，且在有效時間內治療效果與治療時程呈正相關。 賈藍羽等［21］研究發(fā)現(xiàn)缺血7～12 d 后可觀察到毛細血管分支的內皮細胞24 h 開始增殖并持續(xù)至少7 d 的研究結果與本實驗趨同。 干預措施與時間均具有明顯交互作用給予啟示，臨床治療缺血性腦卒中，康復手段的介入和有效治療時間的選取，至關重要。

本實驗表明：電針聯(lián)合康復訓練可通過調控腦缺血后血管新生相關因子VEGF、BDNF 的表達，激活下游PI3K／Akt 信號通路，介導血管新生，以促進神經(jīng)功能恢復。這在一定程度上明確了PI3K／Akt 信號通路的關鍵作用，為腦內血管新生與神經(jīng)功能恢復的關系，豐富腦缺血功能恢復的生物學機制研究，提供實驗依據(jù)。 針康聯(lián)合療法促進腦內血管新生機制中，有無涉及MicroRNA 信號調控尚不清楚，這也是下一步需要深入研究、探討的重要內容。