孫 迪, 楊 雪 瑩, 曾 超, 高 子 晴

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

咖啡因是一種嘌呤類生物堿，是茶、咖啡和可樂等的重要組成成分。隨著茶產(chǎn)品的不斷流行，茶渣的排放問題亟待解決。一方面由于咖啡因在自然條件下不易被降解，會引起土壤鹽堿化，進(jìn)而影響農(nóng)作物的生長，污染環(huán)境[1]；另一方面因茶渣富含蛋白質(zhì)和糖類，可代替?zhèn)鹘y(tǒng)谷類作為飼料，但由于咖啡因的存在，動物食用含咖啡因的茶渣會出現(xiàn)異常躁動和睡眠障礙，進(jìn)而影響肉質(zhì)產(chǎn)量[2-3]。因此，在排放及利用茶渣前對其進(jìn)行脫咖啡因處理顯得尤為重要。相較于常見的脫咖啡因技術(shù)[4]，生物降解法脫咖啡因具有成本低廉、操作簡便和環(huán)境友好等特點，因此受到人們越來越多的關(guān)注[5]。

研究表明，細(xì)菌對咖啡因的降解主要存在兩種途徑：脫甲基途徑和氧化途徑。在已報道的具有咖啡因降解能力的菌株中，80%都通過N-脫甲基途徑降解咖啡因[6]。N-脫甲基途徑是指在降解咖啡因過程中，咖啡因先后在N1和N3位脫甲基酶催化下生成3,7-二甲基黃嘌呤或1,7-二甲基黃嘌呤，經(jīng)代謝中間體7-甲基黃嘌呤轉(zhuǎn)化成甲基尿酸或黃嘌呤，再氧化或水解成甲酸或甲醇，隨后轉(zhuǎn)化成CO2和H2O[7-8]。相較于咖啡因降解菌株的篩選及降解途徑的解析，咖啡因降解酶類的研究卻相對滯后。Woolfolk[9]于1975年確定了N-脫甲基酶的存在及在咖啡因降解中的作用，但由于該酶在提取純化過程中快速失活，使得N-脫甲基酶的研究一直處于停滯狀態(tài)。直到2011年，Summers等[10]才從惡臭假單胞菌CBB5中分離出了一種N-脫甲基酶，這是國內(nèi)外對于脫甲基酶純化的唯一報道。

課題組前期分離得到一株高效咖啡因降解菌ParaburkholderiacaffeinilyticaCF1[11]，并完成了該菌全基因組測序及基因注釋工作，經(jīng)代謝產(chǎn)物鑒定證明其通過N-脫甲基途徑降解咖啡因；利用已報道的咖啡因降解相關(guān)基因序列信息，成功地在P.caffeinilyticaCF1基因組上找到咖啡因N3-脫甲基酶，該酶負(fù)責(zé)催化3,7-二甲基黃嘌呤轉(zhuǎn)化為7-甲基黃嘌呤。由于已報道的N3-脫甲基酶的酶活較低且極不穩(wěn)定，因此本研究在前期實驗的基礎(chǔ)上，利用大腸桿菌表達(dá)體系異源表達(dá)酶活力高、穩(wěn)定性強(qiáng)的N3-脫甲基酶CdnB-His6；通過鎳離子親和層析技術(shù)實現(xiàn)純酶的回收，得到了高酶活力及穩(wěn)定性的N3-脫甲基酶，并對CdnB-His6進(jìn)行催化特性表征，以期為今后咖啡因脫甲基酶系的分子改造及實際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 株

本實驗使用宿主菌株為E.coliRosetta-gamiB(DE3)-pLysS。

1.1.2 培養(yǎng)基

稱取蛋白胨10 g、酵母浸粉10 g及氯化鈉5 g 溶于800 mL去離子水中，將pH調(diào)至7.5后定容到1 L，121 ℃滅菌20 min，備用。

1.1.3 試 劑

限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ、T4 DNA連接酶、蛋白Marker均為Takara產(chǎn)品；BDR溶液與Ni-NTA，上海生工生物公司；考馬斯亮藍(lán)染液：100 mL染色液包括0.1 g的考馬斯亮藍(lán)R-250、25 mL異丙醇及10 mL醋酸，其余用超純水補(bǔ)齊；脫色液：100 mL脫色液含有10 mL醋酸和5 mL乙醇，其余用超純水補(bǔ)齊；酶活測定所需的氧化還原酶CdnB-His6為實驗室從CF1菌株中自主純化出的還原酶。

1.2 方 法

1.2.1 表達(dá)菌株的構(gòu)建

將實驗室自主構(gòu)建的質(zhì)粒pGM-T-CdnB和pET32a表達(dá)質(zhì)粒在BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點分別進(jìn)行雙酶切并連接，在E.coliRosetta-gamiB(DE3)中進(jìn)行異源表達(dá)。

1.2.2 蛋白的表達(dá)純化

將構(gòu)建好的CdnB-His6表達(dá)菌株接種到含有氨芐西林(50 μg/mL)的500 mL LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600=0.5后，加入IPTG至終濃度0.05 mmol/L，15 ℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)16 h。離心收集菌體沉淀，用50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)洗滌2次后，低溫條件下超聲破碎裂解細(xì)胞。將得到的細(xì)胞懸液離心，收集上清，即為粗酶液。

將粗酶液經(jīng)0.22 μm的微孔膜過濾后，上樣到平衡好的鎳離子親和層析柱，用洗滌緩沖液(50 mmol/L 咪唑、50 mmol/L氯化鈉、20 mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH 8.0)洗滌，用洗脫緩沖液(100 mmol/L 咪唑、50 mmol/L氯化鈉、20 mmol/L 磷酸鉀緩沖液，pH 8.0)洗脫，得到純度較高的蛋白溶液。將得到的CdnB-His6純蛋白置于處理好的MWCO 10 000透析袋中，4 ℃于50 mmol/L pH 8.0的磷酸緩沖液中透析6 h后，超濾濃縮備用。

氧化還原酶CdnD-His6的洗滌緩沖液為20 mmol/L 咪唑、50 mmol/L氯化鈉、20 mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH 8.0；洗脫緩沖液為50 mmol/L咪唑、50 mmol/L氯化鈉、20 mmol/L磷酸鉀緩沖液，pH 8.0；其余純化步驟同CdnB-His6。

利用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)濃度[12]。將5 μL 樣品用超純水稀釋到0.5 mL后加入0.5 mL BDR溶液，于25 ℃水浴中反應(yīng)5 min后，用紫外分光光度計在595 nm處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白濃度。

1.2.3 SDS-PAGE及Native-PAGE電泳分析

1.2.3.1 SDS-PAGE電泳

將純化后的CdnB-His6與樣品處理液以1∶1 混勻，95 ℃水浴10 min后，轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心5 min，上樣量15 μL。電泳條件：分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%；電泳開始時電壓60 V，進(jìn)入分離膠后，電壓調(diào)至120 V。考馬斯亮藍(lán)R250染色30 min后，將染色液換為脫色液，置于振蕩儀上脫色3 h，置于凝膠成像儀觀察。

1.2.3.2 Native-PAGE電泳

將純化后的CdnB-His6與樣品處理液以1∶1混勻，上樣量為15 μL。電泳條件為分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%；電泳電壓為170 V?？捡R斯亮藍(lán)R250染色30 min后，脫色3 h，置于凝膠成像儀觀察[13]。

1.2.4 酶活的測定方法

由于單獨的CdnB-His6無法行使脫甲基功能，需要氧化還原酶CdnB-His6的參與，因此按照Summers[10]方法略做修改，酶反應(yīng)體系(1 mL)：1.5 mmol/L 3,7-二甲基黃嘌呤，1 mmol/L NADH，0.05 mmol/L硫酸亞鐵銨，50 mmol/L Tris-鹽酸緩沖液(pH 8.0)，0.2 mg純化的CdnB-His6及0.2 mg氧化還原酶CdnD-His6。按照酶反應(yīng)體系加入試管中，在30 ℃下反應(yīng)20 min后，于100 ℃加熱5 min終止反應(yīng)。以滅活的CdnB-His6蛋白反應(yīng)作為對照，HPLC測定酶反應(yīng)過程中產(chǎn)物的生成量。30 ℃下將1 min生成1 μmol 7-甲基黃嘌呤所需的酶量定義為1個活力單位(U)。

色譜(Waters 2695/2998，USA)條件：Hypersil C-18柱(φ4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為體積比30∶70的甲醇和水，體積流量1 mL/min，紫外檢測波長254 nm，柱溫40 ℃。

1.2.5 CdnB-His6的酶學(xué)性質(zhì)表征

1.2.5.1 酶的底物特異性

分別以咖啡因、3,7-二甲基黃嘌呤、1,3-二甲基黃嘌呤及3-甲基黃嘌呤為底物進(jìn)行酶反應(yīng)，測定酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)研究酶的底物特異性。

酶促反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)的測定方法：分別于0.1、0.2、0.5、1.0及2.0 mmol/L底物濃度下進(jìn)行酶促反應(yīng)，通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法繪制1/cs-1/V0圖，計算米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vmax。

式中：Km為米氏常數(shù)，μmol/L；V0為反應(yīng)速度，μmol/(L·mg·min)；Vmax為最大反應(yīng)速度，μmol/(L·mg·min)；cs為底物濃度，μmol/L。

1.2.5.2 溫度對酶活力的影響

在15、20、25、30、37 ℃下，緩沖液為pH 8.0的Tris鹽酸，每個溫度做3組平行實驗，分別測定酶活力，以滅活的酶作為對照。

1.2.5.3 pH對酶活力的影響及酶的pH穩(wěn)定性

在pH 3.0～11.0分別測定酶活力，每個pH做3組平行實驗，以滅活的酶作為對照。

在pH 3.0～11.0條件下，于4 ℃保溫2 h后，每個pH做3組平行實驗，分別測定殘留酶活力，與最高的酶活力相比，計算百分比，以滅活的酶作為對照。其中，pH 3.0～6.0采用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖體系進(jìn)行調(diào)節(jié)；pH 6.0～8.0采用磷酸二氫鉀-磷酸氫二鉀緩沖體系進(jìn)行調(diào)節(jié)；pH 8.0～10.0采用Tris-鹽酸緩沖體系進(jìn)行調(diào)節(jié)；pH 10.0～11.0采用甘氨酸-氫氧化鈉緩沖體系進(jìn)行調(diào)節(jié)。

1.2.5.4 金屬離子對酶活力的影響

分別向酶反應(yīng)體系中添加不同金屬離子，使其終濃度達(dá)到2 mmol/L，隨后在pH 8.0、30 ℃條件下測定酶活力，以不添加金屬離子的酶反應(yīng)體系作為對照(計為100%)，計算相對酶活力，每種金屬離子做3組平行實驗。選取的金屬離子分別為Na+、K+、Pb2+、Ni2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Mn2+、Cu2+、Co2+和Fe3+。

2 結(jié)果與討論

2.1 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

對實驗室保存的克隆質(zhì)粒pGM-T-CdnB及載體pET32a進(jìn)行雙酶切，于4 ℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliRosetta-gamiB(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。挑取氨芐西林抗性平板上的陽性克隆進(jìn)行重組質(zhì)粒提取。對提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，重組質(zhì)粒經(jīng)BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切后顯示有大小為1 100和5 700 bp的兩條特異性片段，與預(yù)測正確重組質(zhì)粒的酶切結(jié)果一致；對其進(jìn)行菌液PCR鑒定，可觀察到約1 100和1 300 bp的兩條特異性條帶，結(jié)果表明本實驗成功構(gòu)建了N3-脫甲基酶表達(dá)菌株E.coliRosetta-gamiB(DE3)-pLysS-pET32a-CdnB。

2.2 重組蛋白的表達(dá)純化

對細(xì)胞破碎上清液及鎳柱純化后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，如圖1(a)所示。經(jīng)純化后，蛋白條帶單一，雜蛋白已被有效去除，獲得純度大于90%的目的蛋白，分子質(zhì)量為58 ku?？梢钥吹降鞍自诖竽c桿菌中表達(dá)量較高，且分子質(zhì)量大小與預(yù)期一致。此外，對于未添加IPTG誘導(dǎo)劑的陰性對照，細(xì)胞破碎上清液中并未出現(xiàn)目的蛋白質(zhì)表達(dá)條帶，且未檢測到N3-脫甲基酶活性(圖中未顯示)，進(jìn)一步證明圖1(a)中誘導(dǎo)表達(dá)的大小為58 ku的蛋白質(zhì)為N3-脫甲基酶CdnB-His6。

對純化后的CdnB-His6進(jìn)行Native-PAGE分析，如圖1(b)所示。于49.1、116 ku兩條已知大小的蛋白質(zhì)條帶間出現(xiàn)一條單一蛋白質(zhì)條帶，結(jié)合SDS-PAGE分析可知，CdnB-His6是一個分子質(zhì)量為58 ku的單亞基單倍體蛋白。

(a) SDS-PAGE

(b) Native-PAGEM1，標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1，空載；2，粗酶液；3，純化后的CdnB-His6；M2，已知大小蛋白；4，純化后的CdnB-His6圖1 CdnB-His6 的SDS-PAGE和Native-PAGE 電泳圖Fig.1 SDS-PAGE and Native-PAGE of CdnB-His6

2.3 蛋白的紫外可見分光光度分析

將純化后的N3-脫甲基酶(CdnB-His6)在室溫下用紫外可見光譜掃描儀進(jìn)行全波長掃描，波長范圍為200～1 100 nm，如圖2所示。在279、326、460和572 nm處CdnB-His6出現(xiàn)明顯吸收峰，而在添加2 mmol/L還原劑連二亞硫酸鈉后，460及572 nm處的特征峰完全消失，這是鐵硫蛋白特有的光譜特征[14]，說明N3-脫甲基酶CdnB是一種鐵硫蛋白，同時解釋了純化后的CdnB-His6蛋白呈紅褐色的原因。插入的圖像為CdnB-His6與還原型CdnB-His6對比圖。

2.4 N3-脫甲基酶的表征

2.4.1 CdnB-His6的底物特異性分析

Summers[10]等于2012年首次從Pseudomonasputida. CBB5中分離純化出一種N3-脫甲基酶NdmB。相較于NdmB可以作用于所有含有N3位甲基的底物[15]，CdnB-His6表現(xiàn)出更為嚴(yán)格的專一性。在最適條件下，對CdnB-His6進(jìn)行不同底物的酶反應(yīng)，利用HPLC對酶反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離鑒定。結(jié)果顯示，N3-脫甲基酶CdnB-His6只能作用于3,7-二甲基黃嘌呤及3-甲基黃嘌呤。與預(yù)測的蛋白功能相同，即只能對N3位甲基進(jìn)行去甲基化，且不能在N1位甲基存在的情況下進(jìn)行N3位去甲基化。由此推出，CdnB負(fù)責(zé)催化咖啡因降解第二步，即3,7-二甲基黃嘌呤轉(zhuǎn)化為7-甲基黃嘌呤。

Km表示酶和底物的親和能力大小，Km越大，表明酶和底物的親和力越弱；Km越小，則表明酶和底物親和能力越強(qiáng)。因此，通過比較不同底物的Km，如表1所示，由底物3,7-二甲基黃嘌呤的Km稍小于3-甲基黃嘌呤為底物時的Km，得出3,7-二甲基黃嘌呤為CdnB-His6的最適反應(yīng)底物；當(dāng)?shù)孜餄舛冗h(yuǎn)大于Km時，酶促反應(yīng)速率不受底物濃度影響，此時的酶促反應(yīng)為零級反應(yīng)，因此選取1.5 mmol/L作為反應(yīng)中底物的終濃度。CdnB雖然與Summers等[15]分離出的NdmB同為N3-脫甲基酶，與NdmB不同的是，NdmB的最適底物為3-甲基黃嘌呤，一方面可能是由于CdnB-His6和NdmB分別來源于不同的菌屬，另一方面也可能是CdnB-His6具有更為嚴(yán)格的底物特異性導(dǎo)致的。

表1 CdnB-His6的酶學(xué)參數(shù)Tab.1 Apparent kinetic parameters of CdnB-His6

2.3.2 溫度對CdnB-His6酶活力的影響

將制備好的純酶液以3,7-二甲基黃嘌呤為底物進(jìn)行反應(yīng)。從圖3中可以看出，在15～30 ℃，CdnB-His6的活力隨溫度的升高而增大，在30 ℃達(dá)到峰值，顯示最大酶活力；之后隨著溫度的升高，酶活力降低。一般來說，溫度升高有利于提高酶反應(yīng)速度，但同時酶作為一種蛋白質(zhì)也會逐漸變性失活，從而降低反應(yīng)速度。在本實驗中，當(dāng)溫度上升到37 ℃時，純酶活力下降至最適溫度條件下酶活力的60%，說明CdnB-His6蛋白質(zhì)在此溫度下可能已經(jīng)部分變性，表明N3-脫甲基酶CdnB-His6對熱敏感，且最適反應(yīng)溫度為30 ℃。這一結(jié)果與CF1菌株的培養(yǎng)條件相吻合，只有在30 ℃條件下，CF1菌株才會正常生長。

圖3 溫度對CdnB-His6酶活力的影響Fig.3 Effect of temperature on the activity of CdnB-His6

2.3.3 pH對CdnB-His6酶活力的影響及CdnB-His6的pH穩(wěn)定性

在最適反應(yīng)溫度下，將CdnB-His6置于不同pH緩沖體系中，測定其酶活力，結(jié)果如圖4所示。隨著pH升高，CdnB-His6的酶活力逐漸增強(qiáng)，直到pH 8.0時到達(dá)峰值，隨后酶活力隨著pH的升高直線下降。由于pH會改變酶的構(gòu)象，在過酸或過堿的條件下使酶活力喪失，酶活力急劇下降，因此CdnB-His6的最適反應(yīng)pH為8.0(Tris-HCl緩沖體系)。

圖4 pH對CdnB-His6酶活力的影響Fig.4 Effect of pH on the activity of CdnB-His6

pH除了影響酶的反應(yīng)速度外，還會影響酶的穩(wěn)定性。圖5為CdnB-His6在pH 3.0～11.0的酶活，通過酶的殘余活性表現(xiàn)出酶的相對穩(wěn)定性，CdnB-His6在pH 8.0時達(dá)到最大酶活力，于pH 6.5～8.5達(dá)到最大酶活力的60%，甚至更高，而在pH 3.0～6.5及8.5～11.0，酶活力損失嚴(yán)重甚至完全變性失活，說明CdnB-His6既不耐酸也不耐堿，因此CdnB-His6的穩(wěn)定pH區(qū)間為6.5～8.5，適宜于中性環(huán)境。

圖5 CdnB-His6的pH穩(wěn)定性Fig.5 Effect of pH on the stability of CdnB-His6

2.3.4 金屬離子對CdnB-His6酶活力的影響

金屬離子對酶活力的影響較為復(fù)雜，在30 ℃、pH 8.0條件下進(jìn)行酶反應(yīng)，以不添加任何金屬離子的反應(yīng)作為對照，酶活力為21.63 U/mg。從表2中可以看出，F(xiàn)e2+能輕微促進(jìn)脫甲基酶CdnB-His6活性，與CdnB-His6是鐵硫蛋白相一致。Na+對酶活力無明顯作用，而其他離子均不同程度地抑制了酶活力，其中Co2+與Cu2+對酶活力抑制效果最為顯著，其酶活力分別減少到23%和25%，由此可以看出，重金屬對CdnB-His6酶活性影響極大，這也是今后工程菌株的應(yīng)用中所面臨的巨大考驗之一。

表2 金屬離子對CdnB-His6酶活力的影響Tab.2 Effects of metal ions on the activity of CdnB-His6

3 結(jié) 論

本實驗成功構(gòu)建了N3-脫甲基酶表達(dá)菌E.coliRosetta-gamiB(DE3)-pLysS-pET32a-CdnB，且利用高表達(dá)量可溶性CdnB-His6純化出了高純度蛋白，為研究脫甲基酶的結(jié)構(gòu)和功能提供物質(zhì)基礎(chǔ)。對CdnB-His6進(jìn)行酶學(xué)特性研究可知，CdnB-His6是分子質(zhì)量約為58 ku的單亞基單倍體鐵硫蛋白；最適反應(yīng)底物為3,7-二甲基黃嘌呤；最適反應(yīng)溫度為30 ℃；最適反應(yīng)pH為8.0(Tris-HCl體系)；pH穩(wěn)定區(qū)間為6.5～8.5；除Fe2+對其酶活有促進(jìn)作用外，其他離子均不同程度地抑制其活性。