蔡 圣 寶， 李 美 奇， 易 俊 潔

( 昆明理工大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品學(xué)院， 云南 昆明 650500 )

0 引 言

羊棲菜(Hizikiafusiformis)作為一種可食用的海洋藻類植物[1]，廣泛分布于我國的浙江沿海一帶，含有多種活性物質(zhì)，營養(yǎng)價(jià)值高，其中羊棲菜褐藻多酚是羊棲菜中重要的活性物質(zhì)之一，約占藻體干重的2%，主要為間苯三酚衍生物及連苯三酚衍生物，具有抗氧化[2]、抗菌[3]及抑制代謝酶[4]等作用。目前，褐藻多酚的提取方法多種多樣，主要包括有機(jī)溶劑提取法、超聲提取法、微波提取法、酶提取法和臨界流體萃取法等[5]。呂成林等[6]和張麗斌等[7]等均通過乙醇溶劑提取法對(duì)羊棲菜多酚提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，但是提取率不高。為了獲得更高的提取率，采用其他方式輔助乙醇進(jìn)行提取。

方麗等[8]用二次正交旋轉(zhuǎn)法優(yōu)化超聲輔助提取羊棲菜多酚，但未對(duì)超聲功率的影響進(jìn)行探究。本實(shí)驗(yàn)選取超聲功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間等影響條件，采用響應(yīng)面分析法，探討超聲輔助乙醇提取羊棲菜褐藻多酚的最佳工藝條件，以期為羊棲菜褐藻多酚生物活性探索以及后期的開發(fā)利用提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮羊棲菜(Hizikiafusiformis)，浙江省洞頭區(qū)；Folin-Ciocalteu試劑，Merck公司；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SpectraMax M5型多功能酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices；JN-5200DTS型超聲，寧波市科技園區(qū)新江南儀器有限公司；真空泵，德國Vacuubrand。

1.3 方 法

1.3.1 羊棲菜多酚提取方法

準(zhǔn)確稱量羊棲菜5.0 g，按一定料液比加入一定體積分?jǐn)?shù)乙醇溶劑。在40 ℃下，超聲輔助提取一定時(shí)間，用布氏漏斗進(jìn)行抽濾。濾液轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶定容，精密吸取提取液1 mL，在10 mL容量瓶中稀釋10倍后，測(cè)定總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

固定提取溫度40 ℃，依次改變乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率、料液比、提取時(shí)間等因素。各因素的水平梯度為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、60%、70%、80%、90%，超聲功率180、210、240、270 W，料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20 g/mL，提取時(shí)間30、60、90、120 min，考察不同提取條件對(duì)羊棲菜多酚提取量的影響。

1.3.3 褐藻多酚提取量的測(cè)定

羊棲菜不同提取液中褐藻多酚提取量以總酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示?？偡淤|(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定采用Folin-Ciocalteu法并加以修改[9]，取1 mL原液稀釋后，向其中加入去離子水6 mL，再加入0.5 mL福林試劑，靜置1 min，加入1.5 mL 20% Na2CO3，用去離子水定容至10 mL。70 ℃水浴中加熱10 min，冷卻至室溫，用多功能酶標(biāo)儀在765 nm波長(zhǎng)下分別測(cè)定各反應(yīng)液的吸光度。以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，多酚提取量表示為沒食子酸質(zhì)量/羊棲菜質(zhì)量(mg/g)，所有試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

如表1所示，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，選取料液比(A)、超聲功率(B)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)、提取時(shí)間(D)4個(gè)因素為變量，以褐藻多酚提取量為響應(yīng)值，采用4因子3水平的響應(yīng)面分析法，得到二次回歸方程，并得出最佳工藝參數(shù)[10]。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因子與水平Tab.1 Variables and levels in response surface design

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)操作均重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果表示為(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)，結(jié)果利用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行顯著性分析，P<0.05認(rèn)為有顯著性差異(采用Tukey檢測(cè))，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和作圖均在Origin 8.5軟件中完成。采用Design Expert 8.0.6軟件建立二次響應(yīng)回歸模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)褐藻多酚提取量的影響

如圖1所示，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，褐藻多酚提取量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%時(shí)，褐藻多酚提取量達(dá)到最大。出現(xiàn)增加趨勢(shì)的原因可能是褐藻多酚含有酚羥基，易與蛋白質(zhì)、多糖等以氫鍵和疏水鍵形成穩(wěn)定化合物，而乙醇可以斷裂氫鍵，且褐藻多酚的溶解度會(huì)隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而逐漸增加[11]，最終使褐藻多酚提取量增高。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)過高時(shí)會(huì)引起羊棲菜中脂溶性成分浸出較多[12]。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)褐藻多酚提取量的影響Fig.1 The effect of ethanol concentration on the extraction of phlorotannins amount from Hizikia fusiformis

2.2 超聲功率對(duì)羊棲菜褐藻多酚提取量的影響

如圖2所示，在超聲功率為180～240 W時(shí)，羊棲菜褐藻多酚提取量隨著超聲功率的增大而升高，當(dāng)超聲功率達(dá)到240 W時(shí)，褐藻多酚提取量達(dá)到最大值，這可能是由于超聲產(chǎn)生的機(jī)械作用和空化效應(yīng)破碎了植物細(xì)胞壁，有效成分呈游離狀態(tài)溶入提取溶劑中[10]，可見一定功率的超聲處理可以促進(jìn)褐藻多酚的提取。隨著超聲功率繼續(xù)增大，褐藻多酚提取量明顯下降，這可能是由于超聲產(chǎn)生的機(jī)械應(yīng)力過大，增加了植物組織細(xì)胞損傷，使多酚氧化酶和過氧化物酶大量分泌，從而發(fā)生氧化導(dǎo)致酚類物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)有所下降[13]，進(jìn)而造成褐藻多酚提取量下降。

圖2 超聲功率對(duì)褐藻多酚提取量的影響Fig.2 The effect of ultrasound power onthe extraction of phlorotannins amount from Hizikia fusiformis

2.3 料液比對(duì)褐藻多酚提取量的影響

如圖3所示，褐藻多酚提取量隨著料液比增大呈現(xiàn)增大的趨勢(shì)，當(dāng)料液比達(dá)到1∶10時(shí)，褐藻多酚提取量達(dá)到最大，為0.804 mg/g，這可能是由于較多的溶劑進(jìn)入植物組織細(xì)胞，使酚類化合物更容易滲透到溶劑中[11]，從而使提取量上升。但當(dāng)料液比繼續(xù)升高時(shí)，提取劑對(duì)有效成分的提取能力達(dá)到飽和，因此增加提取液的比例會(huì)使雜質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)溶出，并不利于有效成分地提取[14]，同時(shí)還可能造成溶劑的浪費(fèi)，增加成本。

圖3 料液比對(duì)褐藻多酚提取量的影響Fig.3 The effect of solvent to material ratio on the extraction of phlorotannins amount from Hizikia fusiformis

2.4 提取時(shí)間對(duì)褐藻多酚提取量的影響

由圖4可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，褐藻多酚提取量逐漸上升，在30～60 min上升較明顯。在60 min后，褐藻多酚提取量的上升程度逐漸降低，這可能是因?yàn)樵?0 min內(nèi)羊棲菜的有效提取物已基本提取完成，適當(dāng)?shù)难娱L(zhǎng)超聲時(shí)間會(huì)增加褐藻多酚提取量，但是過長(zhǎng)時(shí)間的超聲會(huì)對(duì)羊棲菜的營養(yǎng)成分產(chǎn)生一定的機(jī)械損傷，同時(shí)增加能耗和成本，所以選取最佳提取時(shí)間為60 min。

圖4 提取時(shí)間對(duì)褐藻多酚提取量的影響Fig.4 The effect of extraction time on the content of total phenol

2.5 響應(yīng)面法提取條件優(yōu)化

2.5.1 二次響應(yīng)回歸模型的建立與分析

響應(yīng)面設(shè)計(jì)如表2所示。表中1～24為析因?qū)嶒?yàn)，25～29為中心實(shí)驗(yàn)。29個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)分別是分析因點(diǎn)和零點(diǎn)，析因點(diǎn)是自變量在A、B、C、D組成的三維頂點(diǎn)，零點(diǎn)是區(qū)域中心點(diǎn)，零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，用于實(shí)驗(yàn)誤差的估計(jì)[10]。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Design and results of response surface experiment

利用Design Expert 8.0.6進(jìn)行回歸擬合，得到提取條件與褐藻多酚提取量之間的二次多項(xiàng)回歸方程為

Y=0.97+0.039A+0.022B-0.000 44C+

0.003 75D-0.012AB-0.019AC+

0.039AD-0.043BC+0.001 33BD-

0.009 765CD-0.064A2-0.052B2-

0.048C2-0.075D2

多項(xiàng)式中，Y為羊棲菜褐藻多酚提取量的預(yù)測(cè)值，A、B、C、D分別代表料液比、超聲功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間的編碼值。

表3 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表Tab.3 Significance test of regression coefficients

料液比和超聲功率對(duì)羊棲菜褐藻多酚提取量影響極為顯著，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間對(duì)羊棲菜多酚提取量不顯著。由F值可知，各因素對(duì)于羊棲菜褐藻多酚提取量的影響由高到低依次為料液比(A)、超聲功率(B)、時(shí)間(D)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)。AD、BC、A2、B2、C2、D2極顯著，AC效果顯著，AB、BD、CD間效果不顯著。本實(shí)驗(yàn)中模型擬合效果較好，可以用來對(duì)羊棲菜的褐藻多酚提取量進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

2.5.2 各因素交互作用對(duì)褐藻多酚提取量的影響

由圖5可知，兩因素間的交互作用極顯著。這與表3中方差分析的回歸模型顯著性結(jié)果一致，表明褐藻多酚提取量在一定范圍內(nèi)有極大值。

(a) 料液比與反應(yīng)時(shí)間

(b) 超聲功率和乙醇體積分?jǐn)?shù)圖5 有顯著相互作用的兩因素對(duì)褐藻多酚提取量影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots of the effect of two variables on phlorotannins extraction

2.5.3 最佳反應(yīng)條件的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證

通過回歸模型的預(yù)測(cè)，得到超聲輔助提取羊棲菜中褐藻多酚類物質(zhì)的最佳提取工藝為料液比1∶15，超聲功率217 W，提取時(shí)間69 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)57%，此時(shí)褐藻多酚提取量的理論值最大，為0.941 mg/g。結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，各因素水平調(diào)整為料液比1∶15，超聲功率220 W，提取時(shí)間70 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)57%，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，測(cè)得褐藻多酚提取量為(0.930±0.036) mg/g，與理論值誤差僅為1.169%，證實(shí)了該模型具有有效性。

3 結(jié) 論

采用響應(yīng)面分析法得到超聲輔助乙醇提取羊棲菜褐藻多酚的最佳工藝條件：料液比1∶15，超聲功率217 W，提取時(shí)間69 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)57%。在此條件下，模型預(yù)測(cè)值為0.941 mg/g，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所得多酚提取量為0.930 mg/g，誤差僅為1.169%，表明該模型能較好地預(yù)測(cè)羊棲菜褐藻多酚提取量。超聲輔助乙醇提取法對(duì)提高羊棲菜褐藻多酚的提取率具有顯著效果，應(yīng)用前景較好，該成果也為下一步羊棲菜褐藻多酚生物活性探索提供了前期理論基礎(chǔ)。