章喜林 余歡明 王翔

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境和惡性進(jìn)展過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，肺癌組織周圍浸潤大量巨噬細(xì)胞，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及腫瘤轉(zhuǎn)移、血管生成、免疫抑制，促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展[1-2]。在不同因子的刺激下，巨噬細(xì)胞被激活成M1型或M2型，并發(fā)揮不同的功能。鑒于此，有學(xué)者提出了靶向巨噬細(xì)胞的治療方法[3]。但是關(guān)于腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制以及調(diào)控腫瘤微環(huán)境的作用，目前尚未清楚。近年來，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤來源外泌體可攜帶大量蛋白質(zhì)或核酸并傳遞到受體細(xì)胞或微環(huán)境中，從而影響細(xì)胞與細(xì)胞和（或）細(xì)胞與微環(huán)境之間的信號(hào)調(diào)控，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和惡性進(jìn)展[4-6]。研究表明，非小細(xì)胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）外泌體可通過釋放晶體蛋白甲B來調(diào)控M2型巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[7]。另有研究表明，長鏈非編碼RNA（lncRNA）干擾素誘導(dǎo)GTP酶假基因1（GVINP1）的表達(dá)與肺腺癌患者的預(yù)后密切相關(guān)[8]，但其在NSCLC外泌體中的表達(dá)及臨床意義未見相關(guān)報(bào)道，本研究對(duì)此進(jìn)行探討，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2016年10月至2018年2月在湖州師范學(xué)院附屬第一醫(yī)院手術(shù)并經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診為NSCLC的患者51例（收集外周血標(biāo)本前未予抗腫瘤治療），其中男24例，女27例；年齡28～80（60.73±14.05）歲；腫瘤組織高分化12例，中分化31例，低分化8例；國際抗癌聯(lián)盟第8版肺癌TNM分期[9]：Ⅰ期28例，Ⅱ期12例，Ⅲ期7例，Ⅳ期4例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移5例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例。另選取本院同期健康體檢者45例作為對(duì)照，其中男21例，女24例；年齡36～88（60.48±11.88）歲。收集兩組對(duì)象的外周血標(biāo)本。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過，所有對(duì)象簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 ExoQuickTMExosome Isolation Reagent購自美國 SBI公司（5 ml，EXOQ5A-1）；Total Exosome Isolation（from cell culture media）試劑（50 ml，4478359）、Trizol試劑（100 ml，15596018）購自美國 Invitrogen 公司；5×PrimeScript RT Master Mix（Perfect Real Time）（RR036A）、SYBR GreenTMPremix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（RR420A）購自大連寶日生物Takara公司；CD9（sc-13118）、CD81（sc-166029）、Alix 抗體（sc-53540）購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；脂多糖（1 mg，L2654）購自日本 Sigma公司。NanoDrop 2000分光光度計(jì)購自 ThermoFisher Scientific公司；Applied Biosystems 7500 RT-PCR儀購自美國ABI公司；透射電子顯微鏡G2 spititi FEI購自Tecnai公司；納米顆粒跟蹤分析儀（ZetaView Particle Metrix）購自德國PMX公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和處理 人正常肺上皮細(xì)胞（BEAS-2B）、巨噬細(xì)胞（RAW264.7）和 NSCLC 細(xì)胞（A549、H1299）購自中國科學(xué)院干細(xì)胞庫，所有細(xì)胞用完全培養(yǎng)基DMEM（Hyclone）+10% FBS（Gibco）+100 U/ml penicillin（Sigma）和 100 mg/L streptomycin（Sigma）培養(yǎng)。待細(xì)胞密度為70%～80%，加入無血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集選擇性培養(yǎng)基用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基對(duì)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化影響的實(shí)驗(yàn)分為5組，包括空白對(duì)照組（DMEM培養(yǎng)基）、脂多糖組、BEAS-2B-CM組、A549-CM組、H1299-CM組，分別用DMEM培養(yǎng)基、500 μg/L脂多糖、BEAS-2B培養(yǎng)基、A549培養(yǎng)基、H1299培養(yǎng)基處理RAW264.7細(xì)胞24 h。細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基外泌體對(duì)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化影響的實(shí)驗(yàn)分為3組，包括BEAS-2B組、A549組、H1299組，分別用BEAS-2B培養(yǎng)基、A549培養(yǎng)基、H1299培養(yǎng)基提取的細(xì)胞外泌體處理RAW264.7細(xì)胞24 h。

1.4 外泌體提取 （1）血漿外泌體提?。喝】崭轨o脈血5 ml，室溫靜置 30 min，3 500 g 離心 5 min，取血漿；利用外泌體提取試劑盒（EXOQ5A-1，SBI）提取血漿外泌體。取1 ml血漿加入10 μl Thrombin旋轉(zhuǎn)混勻20 min，10 000g 離心 5 min；取上清液，加入 252 μl ExoQuickTMExosome Isolation Reagent混勻，4 ℃孵育 30 min，1 500g離心30 min，去除上清液。取部分沉淀溶于PBS中，用于電鏡下觀察和納米顆粒跟蹤分析法鑒定；部分沉淀溶于Trizol試劑中，用于RT-PCR檢測(cè)；部分沉淀溶于RIPA裂解液中，用于Western blot檢測(cè)。（2）細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基外泌體提?。?0 ml選擇性培養(yǎng)基經(jīng)梯度離心、0.22 μm過濾后，加入15 ml Total Exosome Isolation（from cell culture media）試劑，4℃孵育過夜，10 000 g離心60 min，去除上清液，將沉淀溶于Trizol試劑中，用于RT-PCR檢測(cè)。

1.5 外泌體電鏡下觀察與納米顆粒跟蹤分析法鑒定（1）外泌體固定于銅網(wǎng)上，靜置1 min，2%醋酸雙氧鈾水室溫染色1 min，在透射電子顯微鏡下觀察并拍照。（2）外泌體經(jīng)PBS稀釋后，采用納米顆粒跟蹤分析法測(cè)定顆粒濃度及直徑。

1.6 CD9、CD81和Alix蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法。外泌體溶于RIPA裂解液中提取總蛋白，12 000 g、4℃離心10 min，取等體積樣品經(jīng)10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳；然后將蛋白轉(zhuǎn)印至0.45 μm PVDF膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入CD9、CD81和Alix特異性抗體4℃孵育過夜。PVDF膜經(jīng)PBST充分洗滌，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠（1∶2 000）室溫孵育1 h。利用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)外泌體中CD9、CD81和Alix蛋白表達(dá)，利用Tanon 5200全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)獲取電泳圖。

1.7 GVINP1及炎癥因子mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 采用RT-PCR法。按照Trizol試劑說明書提取總RNA，分別將血漿和細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基外泌體RNA溶于焦碳酸二乙酯（DEPC）水，經(jīng)NanoDrop 2000檢測(cè)總RNA的質(zhì)量和純度，用 5×PrimeScriptRTMasterMix（PerfectRealTime）逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。合成的cDNA利用SYBR GreenTMPremix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，20 μl反應(yīng)體系包括 10 μl SYBR GreenTMPremix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）、0.6 μl上游引物、0.6 μl下游引物和 50 ng cDNA；反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。PCR 擴(kuò)增結(jié)束后，采用2-ΔΔCt法計(jì)算GVINP1及炎癥因子mRNA表達(dá)水平，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)平行孔。所用引物序列見表1。1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法。計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC患者外周血外泌體的觀察與鑒定 在電鏡下可見NSCLC患者外周血中含有豐富的外泌體，見圖1a；外泌體大小為 26.7～136.1 nm，見圖 1b。

2.2NSCLC患者與健康體檢者血漿外泌體中CD9、CD81和Alix蛋白及GVINP1 mRNA表達(dá)水平比較 NSCLC患者和健康體檢者血漿外泌體中都存在CD9、CD81和Alix蛋白表達(dá)，見圖2a；NSCLC患者血漿外泌體中GVINP1 mRNA表達(dá)水平明顯高于健康體檢者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖 2b。

2.3 不同臨床特征NSCLC患者血漿外泌體中GVINP1的mRNA表達(dá)水平比較 有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期的NSCLC患者血漿外泌體中GVINP1表達(dá)水平較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表2。

2.4 NSCLC細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基中外泌體GVINP1 mRNA表達(dá)水平比較 與人正常肺上皮細(xì)胞（BEAS-2B）選擇性培養(yǎng)基外泌體比較，NSCLC細(xì)胞（A549、H1299）選擇性培養(yǎng)基外泌體中GVINP1 mRNA表達(dá)水平均明顯升高（均 P＜0.05），見圖 3。

2.5 NSCLC細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基對(duì)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響 與空白對(duì)照組比較，BEAS-2B-CM組、A549-CM組、H1299-CM 組 IL-1β、TNF-α、IL-6 mRNA 表達(dá)水平均明顯升高（均P＜0.05），見圖4a-c；而A549-CM組、H1299-CM組IL-10 mRNA水平明顯降低（P＜0.05），見圖4d。

表1 RT-PCR引物序列

圖1 非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者外周血外泌體的觀察與鑒定（a：電鏡下觀察；b：納米顆粒跟蹤分析法測(cè)得外泌體顆粒濃度及直徑）

圖2 NSCLC患者與健康體檢者血漿外泌體中CD9、CD81和Alix蛋白及GVINP1 mRNA表達(dá)水平比較（NSCLC為非小細(xì)胞肺癌，GVINP1為干擾素誘導(dǎo)GTP酶假基因1；a：CD81、CD9和Alix蛋白表達(dá)的電泳圖；b：GVINP1 mRNA表達(dá)水平的比較，與健康體檢者比較，*P＜0.05）

表2 不同臨床特征NSCLC患者血漿外泌體中GVINP1 mRNA表達(dá)水平比較

圖3 NSCLC細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基外泌體中GVINP1 mRNA表達(dá)水平比較（NSCLC為非小細(xì)胞肺癌，GVINP1為干擾素誘導(dǎo)GTP酶假基因 1；與 BEAS-2B 比較，*P＜0.05）

2.6 NSCLC細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基外泌體對(duì)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響 與去除外泌體的選擇性培養(yǎng)基比較，BEAS-2B 組、A549組、H1299組外泌體中 IL-1β、TNF-α、IL-6mRNA表達(dá)水平均明顯升高（均P＜0.05），見圖5a-c；而A549組、H1299組外泌體中IL-10 mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），見圖 5d。

3 討論

肺癌是我國發(fā)病率和死亡率較高的腫瘤之一，其中以NSCLC最為常見[10]。由于早期缺少有效的診斷指標(biāo)，多數(shù)患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于晚期，失去了最佳手術(shù)治療時(shí)機(jī)，而且晚期患者對(duì)化療藥物不敏感，5年生存率僅15%左右[10]。因此，尋找一種新的診斷指標(biāo)，實(shí)現(xiàn)肺癌轉(zhuǎn)移早期診斷與預(yù)后判斷具有重要意義。

lncRNA是一類長度＞200核苷酸、保守性較低但具有高度組織特異性的非編碼RNA[11]。前期研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA是重要的調(diào)控分子，在NSCLC發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中具有重要作用[12-13]。國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR[14]、MALAT1[15]、H19[16]、CCAT2[17]等多種 lncRNA 在肺腺癌中高表達(dá)，且其表達(dá)與肺腺癌診斷和治療密切相關(guān)。Sui等[8]提取TCGA數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，GVINP1在肺腺癌中低表達(dá)，其與 CEBPA-AS1、MIR31HG、RAET1K聯(lián)合檢測(cè)可作為肺腺癌預(yù)后判斷的潛在標(biāo)志物。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GVINP1在NSCLC細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基的外泌體中表達(dá)水平升高，這表明細(xì)胞可選擇性釋放攜帶GVINP1外泌體并作用于受體細(xì)胞，從而影響細(xì)胞功能。筆者在NSCLC患者血漿外泌體中也發(fā)現(xiàn)了相同的結(jié)果，且其表達(dá)與患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，這與先前肺腺癌組織中的研究結(jié)果不一致[8]，表明GVINP1可能具有雙重作用。多項(xiàng)研究表明，lncRNA在癌癥進(jìn)展中可表現(xiàn)為兩面性。如MALAT1通過激活或失活相鄰前轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)錄因子（TEAD）可促進(jìn)或抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移[18]；DDX3在肺癌進(jìn)展中也存在雙重作用，一方面可激活Wnt信號(hào)通路來促進(jìn)肺癌進(jìn)展，另一方面可激活MDM2/Slug/E-cadherin信號(hào)通路來抑制肺癌進(jìn)展[19]。這些結(jié)果表明，GVINP1在NSCLC癌組織和外泌體中可能發(fā)揮著不同功能，抑制或促進(jìn)肺癌進(jìn)展。

圖4 非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基對(duì)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響（a：IL-1β mRNA表達(dá)水平；b：TNF-α mRNA表達(dá)水平；c：IL-6 mRNA 表達(dá)水平；d：IL-10 mRNA 表達(dá)水平；*P＜0.05）

腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞是一類浸潤在腫瘤組織中的單核細(xì)胞，是腫瘤微環(huán)境的重要組成部分。大量研究表明，這類細(xì)胞可參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥等多個(gè)過程，從而促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展。近年來，鑒于腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的重要調(diào)控作用，有學(xué)者提出靶向腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的治療方式并取得了明顯效果，使患者生存質(zhì)量有了明顯提升[3]。前期研究發(fā)現(xiàn)，M2型巨噬細(xì)胞可介導(dǎo)上調(diào)晶體蛋白甲B表達(dá)，促進(jìn)NSCLC細(xì)胞遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移[7]。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，NSCLC細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基和外泌體處理巨噬細(xì)胞可促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞活化。這些結(jié)果表明NSCLC可能介導(dǎo)上調(diào)外泌體GVINP1表達(dá)，促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞活化，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。

綜上所述，本研究首次闡明了NSCLC細(xì)胞外泌體可促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并發(fā)現(xiàn)NSCLC細(xì)胞和NSCLC患者外周血中的外泌體GVINP1表達(dá)明顯升高，且與患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示NSCLC可能介導(dǎo)外泌體GVINP1調(diào)控巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展。但本項(xiàng)目也存在一定的不足，如不能直接證明外泌體GVINP1在巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中的作用，還需要更多證據(jù)去證明外泌體GVINP1在NSCLC組織和巨噬細(xì)胞以及腫瘤微環(huán)境中的作用及機(jī)制，為NSCLC患者預(yù)后改善提供新的靶點(diǎn)。

圖5 非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）細(xì)胞選擇性培養(yǎng)基外泌體對(duì)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響（a：IL-1β mRNA表達(dá)水平；b：TNF-α mRNA表達(dá)水平；c：IL-6 mRNA 表達(dá)水平；d：IL-10 mRNA 表達(dá)水平；*P＜0.05）