李芳芳 葛星星 朱堅(jiān)勝

肝細(xì)胞癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率均較高[1]。早期診斷、早期治療、術(shù)后隨訪復(fù)查是提高肝細(xì)胞癌患者5年生存率的重要手段；然而，目前仍缺乏靈敏、可靠的分子生物學(xué)標(biāo)志物。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（LncRNA）被定義為長(zhǎng)度＞200個(gè)核苷酸的非蛋白質(zhì)編碼RNA轉(zhuǎn)錄物[2]。越來(lái)越多研究表明，LncRNA與多種腫瘤有關(guān)，如乳腺癌、肺癌、前列腺癌、肝細(xì)胞癌等[3]。LncRNA Neat1是由11號(hào)染色體上1個(gè)被稱(chēng)為家族性腫瘤綜合征多發(fā)性?xún)?nèi)分泌腫瘤1型的基因位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄而來(lái)，是編碼 Neat1_v1（3.7kb）和 Neat1_v2（23kb）兩種變體的LncRNA[4]。目前已在很多惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)LncRNANeat1表達(dá)異常，包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤[5]、人喉鱗狀細(xì)胞癌[6]、乳腺癌[7]、胃癌[8]、食管癌[9]等。這些研究認(rèn)為，LncRNA Neat1異常表達(dá)是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可作為治療干預(yù)的潛在靶標(biāo)。本研究檢測(cè)肝細(xì)胞癌患者癌組織及其癌旁正常組織以及肝癌細(xì)胞株、正常人肝細(xì)胞株中LncRNA Neat1的表達(dá)，分析肝細(xì)胞癌患者癌組織LncRNA Neat1表達(dá)與臨床特征的關(guān)系，同時(shí)探討LncRNA Neat1表達(dá)對(duì)肝細(xì)胞癌的診斷價(jià)值，以期為臨床診治提供參考，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2016年1月至2017年12月在浙江省臺(tái)州醫(yī)院肝膽外科接受手術(shù)的16例肝細(xì)胞癌患者為研究對(duì)象，其中男14例，女2例；年齡36～73（58.81±9.50）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)后病理檢查證實(shí)為肝細(xì)胞癌；（2）術(shù)前未接受過(guò)其他抗癌治療；（3）臨床資料完整。收集所有患者癌組織及癌旁正常肝組織（距腫瘤2 cm以上）標(biāo)本。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)，所有患者簽署知情同意書(shū)。

1.2 細(xì)胞株培養(yǎng) 正常人肝細(xì)胞（LO2）、人高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞（MHCC97-H）、人低轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞（MHCC97-L）均購(gòu)自上海酶研生物有限公司。使用含10% FBS及雙抗（100 U/ml青霉素+100 mg/L鏈霉素）的高糖DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 資料收集 收集患者性別、年齡、腫瘤分化程度、腫瘤部位以及血清甲胎蛋白、ALT、AST、TBil水平等資料。

1.4 癌組織、癌旁正常組織及細(xì)胞株中LncRNA Neat1相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 采用qRT-PCR法。采用Trizol法提取LO2、MHCC97-H、MHCC97-L細(xì)胞株以及16例肝細(xì)胞癌患者癌組織及其癌旁正常組織的總RNA，采用核酸分析儀檢測(cè)所提取RNA的濃度和純度，取適宜純度（1.8～2.0）的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。將RNA逆轉(zhuǎn)為CDNA，并以其為模板進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)體系20 μl（包括上下游特異性 PCR 引物各 0.3 μl、cDNA 模板 1 μl、滅菌超純水 8.4 μl、SYBR Green I qPCR Master Mix 10 μl；反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60℃1 min，共40個(gè)循環(huán)。Neat1的引物根據(jù)美國(guó)生物技術(shù)信息中心已發(fā)表的LncRNA Neat1序列設(shè)計(jì)，并由生工生物工程（上海）公司合成，引物序列見(jiàn)表1。采用2-ΔΔCt法計(jì)算 LncRNA Neat1 相對(duì)表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；兩組比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用Fisher確切概率法。血清ALT、AST、TBil水平與癌組織LncRNA Neat1相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)。繪制ROC曲線分析LncRNA Neat1相對(duì)表達(dá)量診斷肝細(xì)胞癌的效能。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞癌組織與癌旁正常組織中LncRNA Neat1相對(duì)表達(dá)量比較 肝細(xì)胞癌組織LncRNA Neat1相對(duì)表達(dá)量為0.46±0.38，明顯低于癌旁正常組織的1.41±1.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.435，P＜0.05）。

2.2 患者臨床特征與癌組織中LncRNA Neat1相對(duì)表達(dá)量的關(guān)系 不同腫瘤分化程度患者癌組織LncRNA Neat1相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；不同性別、年齡、腫瘤部位、甲胎蛋白水平患者LncRNA Neat1相對(duì)表達(dá)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表 2?；颊哐?ALT、AST、TBil水平與癌組織LncRNA Neat1相對(duì)表達(dá)量均未見(jiàn)相關(guān)（rs=-0.251、-0.134、-0.296，均 P ＞0.05）。

表2 不同臨床特征患者癌組織LncRNA Neat1相對(duì)表達(dá)量比較

2.3 LncRNA Neat1相對(duì)表達(dá)量診斷肝細(xì)胞癌的效能LncRNA Neat1相對(duì)表達(dá)量診斷肝細(xì)胞癌的AUC、約登指數(shù)、靈敏度、特異度分別為 0.793、0.500、0.875、0.625，見(jiàn)圖1。

圖1 LncRNA Neat1相對(duì)表達(dá)量診斷肝細(xì)胞癌的ROC曲線（LncRNA為長(zhǎng)鏈非編碼RNA）

2.4 MHCC97-H、MHCC97-L、LO2 細(xì) 胞 株 LncRNA Neat相對(duì)表達(dá)量比較 MHCC97-H、MHCC97-L、LO2細(xì)胞株LncRNA Neat1相對(duì)表達(dá)量分別為0.24±0.20、0.39±0.08、1.01±0.20，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=18.181，P＜0.05）；與 LO2 細(xì)胞株比較，MHCC97-L、MHCC97-H 細(xì)胞株相對(duì)表達(dá)量明顯降低（均P＜0.05）；MHCC97-L與MHCC97-H細(xì)胞株相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。

3 討論

有研究表明，肝細(xì)胞癌的診斷時(shí)間對(duì)疾病進(jìn)展、早期治療的有效性、5年生存率等起著決定性作用[10]。甲胎蛋白是目前臨床上最常用的篩選和診斷肝細(xì)胞癌的血清診斷標(biāo)志物之一，但在急慢性肝炎、肝硬化、妊娠期婦女等人群中也可出現(xiàn)不同程度的升高；此外，有20%～30%的肝細(xì)胞癌患者血清甲胎蛋白表達(dá)為低水平（陰性結(jié)果）。

由于LncRNA在生物體液中較為穩(wěn)定，已成為癌癥的診斷生物標(biāo)志物之一[11]。有研究表明LncRNA在腫瘤發(fā)生的多個(gè)病理過(guò)程中起作用，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、血管生成等[12]。已有多項(xiàng)證據(jù)表明LncRNA可以通過(guò)調(diào)節(jié)肝癌干細(xì)胞的自我更新能力和其他生物學(xué)功能來(lái)影響肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展[13-16]。LncRNA Neat1是幾種癌癥發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，但目前對(duì)其在惡性腫瘤中的作用尚不十分明確。Gibb等[17]匯編了272個(gè)基因表達(dá)的人類(lèi)系列分析文庫(kù)并開(kāi)發(fā)了新的LncRNA發(fā)現(xiàn)渠道，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LncRNA Neat1在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平低于正常組織。但Guo等[18]報(bào)道Neat1在肝細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，且與肝細(xì)胞癌患者臨床特征密切相關(guān)，包括腫瘤數(shù)量、大小、轉(zhuǎn)移以及TNM分期、門(mén)靜脈腫瘤栓子狀態(tài)、血管侵襲、腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)等。而Xiong等[19]基于57個(gè)微陣列和RNA-seq數(shù)據(jù)集得出的結(jié)果證實(shí)LncRNA Neat1在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)是下調(diào)的。

本研究采用qRT-PCR法檢測(cè)16例肝細(xì)胞癌患者的癌組織及癌旁正常組織以及肝癌細(xì)胞、正常人肝細(xì)胞中LncRNA Neat1的表達(dá)差異，結(jié)果顯示肝細(xì)胞癌組織、肝癌細(xì)胞中的表達(dá)分別低于癌旁正常組織、正常人肝細(xì)胞，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。筆者進(jìn)一步分析肝細(xì)胞癌患者LncRNA Neat1表達(dá)水平與臨床特征的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LncRNA Neat1表達(dá)水平與腫瘤分化程度有關(guān)，與其他臨床特征（如年齡、性別、腫瘤部位以及血清甲胎蛋白、ALT、AST、TBil水平）等均無(wú)關(guān)。可見(jiàn)，甲胎蛋白陰性的肝細(xì)胞癌患者也可能出現(xiàn)LncRNA Neat1表達(dá)異常。提示LncRNA Neat1檢測(cè)早期肝細(xì)胞癌較甲胎蛋白更靈敏。筆者認(rèn)為臨床上采用甲胎蛋白聯(lián)合LncRNA Neat1檢測(cè)將提高肝細(xì)胞癌的早期診斷率。本研究還通過(guò)繪制ROC曲線分析了LncRNA Neat1的診斷效能，發(fā)現(xiàn)AUC、約登指數(shù)、靈敏度、特異度分別為0.793、0.500、0.875、0.625，提示 LncRNA Neat1 有望成為診斷肝細(xì)胞癌的一種新型腫瘤標(biāo)志物。然而，本研究與Guo等[17]得出的結(jié)果并不一致，筆者認(rèn)為存在實(shí)驗(yàn)差異的原因，一方面可能是樣本來(lái)源、總RNA提取方法、LncRNA Neat1表達(dá)檢測(cè)方法不同所致；另一方面，LncRNA Neat1 有 2 種變體：Neat1_v1 和 Neat1_v2[4]，盡管這2種變體共享相同的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，但兩者3′末端加工機(jī)制是不同的，這2種轉(zhuǎn)錄物在腫瘤中可能起不同的作用[20]。Wu等[21]檢測(cè)了結(jié)直腸癌患者全血、癌組織和癌旁組織中Neat1_v1和Neat1_v2的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)Neat1_v1和Neat1_v2在結(jié)直腸癌患者全血中均高表達(dá)，但腫瘤組織、正常組織中Neat1_v1與Neat1_v2表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)證明Neat1_v1可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲，而Neat1_v2在腫瘤增殖中起到抑制作用。Gao等[22]使用Ficoll-Paque方法分離來(lái)自白血病患者和健康人群的外周血白細(xì)胞樣品并對(duì)Neat1_v1和Neat1_v2進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)白血病樣本中Neat1_v1的表達(dá)水平低于正常樣本，而Neat1_v2表達(dá)水平卻與正常樣本相似。從上述研究可以得出，這2種Neat1變體表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化可能影響Neat1作為癌基因或腫瘤抑制因子的主要功能。目前對(duì)Neat1_v1和Neat1_v2在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)模式和作用的研究還十分有限，迫切需要進(jìn)一步研究來(lái)闡明Neat1_v1和Neat1_v2這2種變體在肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中的確切作用。

綜上所述，本研究結(jié)果提示肝細(xì)胞癌組織及肝癌細(xì)胞株中LncRNA Neat1表達(dá)明顯降低，肝細(xì)胞癌組織LncRNA Neat1表達(dá)與腫瘤分化程度密切相關(guān)。LncRNA Neat1有望成為診斷肝細(xì)胞癌的新型腫瘤標(biāo)志物。然而，本研究未闡明LncRNA Neat1在肝細(xì)胞癌中發(fā)揮作用的具體機(jī)制，需要進(jìn)一步研究明確。