俞越 蔡菁

蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是由于顱內(nèi)血管壁完整性受到破壞，血液直接流入蛛網(wǎng)膜下腔引起的一種臨床綜合征，主要由顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂引起。文獻(xiàn)報(bào)道SAH患者在初次發(fā)病時(shí)病死率即高達(dá)30%，且幸存患者常遺留不同程度的神經(jīng)功能障礙[1]。早期腦損傷（early brain injury，EBI）是指 SAH 發(fā)生 72 h內(nèi)腦組織的損傷過程。越來(lái)越多的研究表明，EBI是SAH預(yù)后不良的關(guān)鍵因素[2-3]。EBI的病理機(jī)制十分復(fù)雜，炎癥反應(yīng)是SAH后EBI發(fā)生、發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。因此，深入研究SAH后炎癥反應(yīng)的相關(guān)機(jī)制，研發(fā)針對(duì)性治療措施，對(duì)于減輕EBI、改善SAH患者預(yù)后具有重要意義。Akt作為一種蛋白激酶，在神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等部位均廣泛表達(dá)[4]。它是調(diào)控細(xì)胞發(fā)育、存活等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中的一個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，以往對(duì)Akt的研究多著眼于抗凋亡效應(yīng)[5]。最新研究表明，Akt能夠結(jié)合其下游靶點(diǎn)GSK-3β，并促進(jìn)后者發(fā)生磷酸化，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)[6]。金絲桃苷是提取自藥用植物蘆丁的黃酮醇苷類化合物?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，金絲桃苷具有抗氧化應(yīng)激、減輕細(xì)胞凋亡、改善心血管功能、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等多重藥理學(xué)作用，是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)中藥單體[7]。近期有研究指出，Akt信號(hào)通路是金絲桃苷發(fā)揮心肌保護(hù)等多種藥理學(xué)作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)[8]。然而，金絲桃苷及其介導(dǎo)的Akt信號(hào)通路能否影響SAH后EBI病理過程，目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。因此，本研究擬通過構(gòu)建大鼠SAH模型，探討金絲桃苷在SAH后EBI病理過程中的作用及其分子機(jī)制，以期為SAH治療提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 192只體重280～320 g的健康雄性SD大鼠購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，飼養(yǎng)于浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)溫度（22±3）℃，動(dòng)物自由覓食、飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。動(dòng)物相關(guān)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容經(jīng)浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過，實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格遵守動(dòng)物實(shí)驗(yàn)原則指南（1996年修訂版）的要求。

1.2 主要藥物與試劑 金絲桃苷（純度≥98%）購(gòu)自南京澤朗農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司；Akt抑制劑MK2206購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；2%伊文思藍(lán)溶液購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；二喹啉甲酸（BCA）試劑盒、Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自美國(guó) Thermo Fisher公司；β-actin、Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3 等兔抗大鼠一抗，Iba-1 山羊抗大鼠一抗均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自北京中衫金橋公司；驢抗山羊熒光二抗購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；封閉液、一抗稀釋液、二抗稀釋液購(gòu)自武漢碧云天有限公司；RIPA裂解液購(gòu)自碧云天生物科技有限公司；loading buffer購(gòu)自福德生物技術(shù)公司。

1.3 大鼠SAH模型的建立 采用頸內(nèi)動(dòng)脈穿刺法建立大鼠SAH模型[9]。SD大鼠用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔麻醉后，仰臥位固定在手術(shù)架上。分離并暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，經(jīng)頸外動(dòng)脈向頸內(nèi)動(dòng)脈置入4-0單絲尼龍線，在尼龍線頭端距頸總動(dòng)脈分叉處18～19 mm稍感阻力時(shí)，再向內(nèi)送入約4 mm刺破動(dòng)脈管壁，造成SAH；約15 s后迅速退出尼龍線，用絲線結(jié)扎頸外動(dòng)脈殘端，恢復(fù)血流，縫合頸部切口。假手術(shù)（sham）組大鼠除不刺破動(dòng)脈管壁外，其余步驟相同。麻醉未清醒前繼續(xù)給予電熱毯保暖，術(shù)后大鼠單籠飼養(yǎng)。采用過量1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）深度麻醉處死大鼠并獲取腦組織標(biāo)本，枕大池、基底池、小腦、腦干或大腦表面有血凝塊存在即建模成功。若建模失敗，則以備用動(dòng)物補(bǔ)充。

1.4 動(dòng)物分組與給藥 整個(gè)實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)部分進(jìn)行。（1）金絲桃苷對(duì)SAH大鼠的保護(hù)作用及最佳治療濃度確定：將60只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為sham組、SAH+0.9%氯化鈉溶液（SAH+vehicle）組、SAH+10 mg/kg金絲桃苷（SAH+Hyp-L）組、SAH+25 mg/kg金絲桃苷（SAH+Hyp-M）組、SAH+50 mg/kg金絲桃苷（SAH+Hyp-H）組，每組12只。在建模后24 h評(píng)估神經(jīng)功能，隨后處死大鼠評(píng)估SAH嚴(yán)重性評(píng)分，檢測(cè)腦組織含水量（每組6只）和血腦屏障通透性（每組6只）。（2）金絲桃苷對(duì)SAH大鼠炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用：將36只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為sham組、SAH+0.9%氯化鈉溶液（SAH+vehicle）組、SAH+50 mg/kg金絲桃苷（SAH+Hyp）組。在建模后24 h，采用免疫熒光法檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞激活情況（每組6只），qRT-PCR法檢測(cè)炎癥因子水平（每組6只）。（3）金絲桃苷調(diào)控SAH大鼠炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制：將96只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為sham組、SAH+0.9%氯化鈉溶液（SAH+vehicle）組、SAH+50 mg/kg金絲桃苷（SAH+Hyp）組、SAH+50 mg/kg金絲桃苷+Akt抑制劑（SAH+Hyp+MK2206）組。在建模后24 h評(píng)估神經(jīng)功能，采用 Western blot法檢測(cè) Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3β水平（每組6只），qRT-PCR法檢測(cè)炎癥因子水平（每組6只），同時(shí)檢測(cè)腦組織含水量（每組6只）和血腦屏障通透性（每組6只）。金絲桃苷采用灌胃給藥法，按10、25、50 mg/kg稱取金絲桃苷并溶解于1ml的0.9%氯化鈉溶液中，建模前30 min進(jìn)行灌胃給藥；sham組、SAH+vehicle組大鼠在相同時(shí)間點(diǎn)給予1 ml的0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行灌胃。以2 μg/μl的濃度將10 μg MK2206溶解于0.9%氯化鈉溶液中，在建模前30 min使用立體定位儀注射至大鼠側(cè)腦室內(nèi)。

1.5 神經(jīng)功能及出血程度評(píng)估 采用改良的加西亞評(píng)分體系評(píng)估大鼠神經(jīng)功能，得分越低表示神經(jīng)功能越差[10]。采用Sugawara評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)出血程度進(jìn)行評(píng)分，總分0～18分[11]，得分越高表示SAH越嚴(yán)重。

1.6 腦組織含水量測(cè)定 將大鼠深度麻醉處死后迅速取出腦組織，稱取濕重。隨后置于100℃烘箱烘干72 h直至重量不再變化，測(cè)定干重。腦組織含水量=［（濕重-干重）/濕重］×100%。

1.7 血腦屏障通透性測(cè)定 取材前1 h經(jīng)微靜脈注射2%伊文思藍(lán)溶液（5 ml/kg）至大鼠體內(nèi)。循環(huán)1 h后處死大鼠，經(jīng)PBS灌注后取出左側(cè)半球并稱重。隨后將腦組織浸潤(rùn)于甲酰胺溶液，60℃孵育24 h后收集浸出液，使用酶標(biāo)儀在620 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度（OD）值，評(píng)估血腦屏障通透性。

1.8 小膠質(zhì)細(xì)胞激活情況觀察 采用免疫熒光法。大鼠深度麻醉后，依次經(jīng)心臟灌注PBS和4%多聚甲醛后，取出腦組織置于4%多聚甲醛固定24 h，隨后轉(zhuǎn)移至30%蔗糖溶液脫水至沉底。將大鼠腦組織切至8 μm厚冷凍切片，用5%驢血清封閉后，滴加山羊抗大鼠I－ba-1一抗，4℃孵育過夜。洗滌后滴加驢抗山羊熒光二抗（美國(guó)Invitrogen公司），37℃避光孵育1 h后洗滌。封片后于熒光顯微鏡下觀察Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量，即小膠質(zhì)細(xì)胞激活情況。

1.9 腦組織炎癥因子mRNA相對(duì)表達(dá)量檢測(cè) 采用qRT-PCR法。Trizol法提取左側(cè)大腦皮質(zhì)組織內(nèi)的總RNA，隨后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)以下體系進(jìn)行qRT-PCR：5 μl反應(yīng)混合物+0.25 μl上下游引物溶液+500 ng cDNA模板，補(bǔ)充焦碳酸二乙酯（DEPC）水至 10 μl。qRT-PCR 引物由 Takara公司設(shè)計(jì)合成，引物序列見表1。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法計(jì)算 TNF-α、IL-1β、IL-6、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.10 腦組織Akt、GSK-3β等蛋白相對(duì)表達(dá)量檢測(cè)采用Western blot法。腦組織加入RIPA裂解液，超聲勻漿，4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清液，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。隨后加入5×loading buffer，100℃加熱5 min，置于-80℃保存。10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，每孔加入40 μg總蛋白樣品；在250 mA下將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜，5%牛血清白蛋白室溫下封閉1 h，將膜分別與 β-actin、Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3等兔抗大鼠一抗于4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗滌；在室溫下孵育辣根過氧化物酶標(biāo)價(jià)的小鼠抗兔二抗1 h，TBST緩沖液洗滌后；ECL法顯影后，以β-actin為參數(shù)，用Image J軟件計(jì)算各條帶灰度值，即Akt、GSK-3β、p-Akt、p-GSK-3β 蛋白相對(duì)表達(dá)量；p-Akt、GSK-3β 的磷酸化水平（p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β） 分別用 p-Akt、p-GSK-3β的灰度值與各自總蛋白灰度值的比值表示。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Graphpad Prism6軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果

2.1 金絲桃苷對(duì)SAH大鼠的保護(hù)作用及最佳治療濃度 各模型組大鼠出血程度評(píng)分比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與sham組相比，各模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分均明顯下降（均P＜0.05），腦組織含水量均明顯升高（均P＜0.05），血腦屏障通透性亦明顯增加（均P＜0.05）。與SAH+vehicle組相比，金絲桃苷治療組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯升高（均P＜0.05），腦組織含水量明顯減少（均P＜0.05），血腦屏障通透性明顯降低（均P＜0.05），且呈劑量遞增效應(yīng)，見圖1。因此，本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇50 mg/kg作為金絲桃苷的治療濃度。

表1 qRT-PCR引物序列

2.2 金絲桃苷對(duì)SAH大鼠炎癥反應(yīng)的調(diào)控 與sham組相比，SAH+vehicle組大鼠腦組織內(nèi)Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增加，TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS、MCP-1 等炎癥因子水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與SAH+vehicle組相比，SAH+Hyp組大鼠腦組織內(nèi)Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，上述炎癥因子水平亦明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），提示金絲桃苷能抑制SAH后的炎癥反應(yīng)，見圖2-3。

2.3 金絲桃苷調(diào)控SAH大鼠炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制與sham組相比，SAH+vehicle組大鼠腦組織內(nèi)p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β 均明顯下降（均 P＜0.05）；與SAH+vehicle組相比，SAH+Hyp組大鼠腦組織內(nèi)p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β明顯升高（均 P＜0.05）；與 SAH+Hyp 組相比，SAH+Hyp+MK2206 組 p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β及神經(jīng)功能評(píng)分均明顯降低（均P＜0.05），而各炎癥因子水平、腦組織含水量及血腦屏障通透性均明顯增加（均P＜0.05），提示SAH后大鼠Akt/GSK-3β信號(hào)通路被抑制，而金絲桃苷能在SAH后顯著上調(diào)Akt/GSK-3β信號(hào)通路的激活水平，見圖4。

圖1 金絲桃苷對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）后大鼠神經(jīng)功能、出血程度、腦組織含水量及血腦屏障通透性的影響（a：神經(jīng)功能評(píng)分；b：出血程度評(píng)分；c：腦組織含水量；d：血腦屏障通透性；與sham組比較，*P＜0.05；與SAH+vehicle組比較，△P＜0.05；與SAH+Hyp-L組比較，▲P＜0.05）

圖2 金絲桃苷對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）后大鼠腦組織內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響（a：免疫熒光染色圖，×200，DAPI為4′，6-二脒基-2-苯基吲哚，Merge為合并重疊；b：Iba-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量比較，與sham組比較，*P＜0.05，與SAH+vehicle組比較，△P＜0.05）

圖3 金絲桃苷對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）后大鼠腦組織內(nèi)炎癥因子水平的影響[a：TNF-α；b：IL-1β；c：IL-6；d：誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）；e：?jiǎn)魏思?xì)胞趨化蛋白 1（MCP-1）；與 sham 組比較，*P＜0.05；與 SAH+vehicle 組比較，△P＜0.05]

3 討論

金絲桃苷作為一種具有抗氧化應(yīng)激、改善心血管功能、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等多種藥理學(xué)作用的中藥單體，日益受到學(xué)者的關(guān)注[12-13]。然而，關(guān)于金絲桃苷在SAH病理過程中的作用及機(jī)制，目前尚無(wú)確切研究。本研究初步探索了金絲桃苷在SAH后的效應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)金絲桃苷治療能明顯減輕SAH后的腦水腫、減少血腦屏障破壞。更為重要的是，金絲桃苷能夠明顯減輕SAH引起的神經(jīng)功能障礙，且療效呈劑量遞增效應(yīng)。以上結(jié)果提示金絲桃苷能在SAH后發(fā)揮強(qiáng)大的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。

神經(jīng)炎癥是SAH后EBI的關(guān)鍵致病機(jī)制，與SAH預(yù)后不良有關(guān)[14]。小膠質(zhì)細(xì)胞作為常駐中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細(xì)胞，能夠快速感知各種病理刺激，并作出迅速應(yīng)答。激活的小膠質(zhì)細(xì)胞一方面能夠通過合成和釋放炎癥因子，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞造成直接殺傷；另一方面，小膠質(zhì)細(xì)胞還可通過分泌MCP-1等趨化因子，進(jìn)一步招募中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，最終放大炎癥反應(yīng)，加重腦組織損傷[15]。越來(lái)越多的研究證實(shí)，通過多種途徑抑制SAH后小膠質(zhì)細(xì)胞的異常激活，能夠有效地抑制炎癥反應(yīng)，進(jìn)而緩解EBI，改善SAH的預(yù)后[16-17]。筆者進(jìn)一步探討了金絲桃苷在SAH后對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)炎癥的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)大鼠SAH后腦組織內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞被激活，且有大量炎癥因子合成，提示SAH后發(fā)生了顯著的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，這與Gris等[18]研究結(jié)果類似；但給予金絲桃苷治療后，小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和炎癥因子的合成均被明顯抑制，提示金絲桃苷能夠在SAH后抑制炎癥反應(yīng)，進(jìn)而減輕EBI。

Akt作為廣泛分布于真核細(xì)胞的蛋白激酶，能夠通過激活其下游靶點(diǎn)參與細(xì)胞發(fā)育、分化和存活等一系列關(guān)鍵的生命過程[4]。以往研究主要集中在Akt對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。Gugliandolo等[19]證實(shí)，Akt信號(hào)通路異常失活可引起多巴胺能神經(jīng)元的凋亡，加速帕金森病等多種退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理進(jìn)程。在腦外傷、脊髓損傷等疾病模型中也發(fā)現(xiàn)，通過外源性藥物特異性激活A(yù)kt信號(hào)通路，能夠減輕神經(jīng)元凋亡，改善運(yùn)動(dòng)功能[20-21]。近期研究指出，Akt同樣參與了炎癥反應(yīng)這一重要的生命過程。Akt能夠磷酸化GSK-3β第9號(hào)位點(diǎn)上的絲氨酸殘基，促進(jìn)GSK-3β的激活。隨后，激活的Akt/GSK-3β信號(hào)通路可以進(jìn)一步調(diào)控下游NF-κB和mTOR等靶點(diǎn)，減輕炎癥反應(yīng)[22]?？紤]到金絲桃苷能夠在體外激活A(yù)kt信號(hào)通路[23]，筆者推測(cè)Akt/GSK-3β可能參與了金絲桃苷在SAH后的抗炎效應(yīng)。最后，本研究通過給予MK2206來(lái)特異性地阻斷Akt/GSK-3β信號(hào)通路，以探討金絲桃苷發(fā)揮抗炎作用的分子機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)特異性地阻斷Akt/GSK-3β信號(hào)在逆轉(zhuǎn)金絲桃苷抗炎作用的同時(shí)，也消除了金絲桃苷減輕腦水腫、減少血腦屏障破壞、改善神經(jīng)功能等部分保護(hù)效應(yīng)。以上結(jié)果提示Akt/GSK-3β調(diào)控的抗炎信號(hào)通路參與了金絲桃苷在SAH后的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。

圖4 金絲桃苷對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血（SAH）后大鼠神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)與Akt/GSK-3β信號(hào)通路的關(guān)系[a：p-Akt、Akt、p-GSK-3β、GSK-3β蛋白表達(dá)的電泳圖；b：p-Akt/Akt水平；c：p-GSK-3β/GSK-3β 水平；d-h：TNF-α、IL-1β、IL-6、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）等炎癥因子水平；i：腦組織含水量；j：血腦屏障通透性；k：神經(jīng)功能評(píng)分；與sham組比較，*P＜0.05；與SAH+vehicle組比較，△P＜0.05；與 SAH+Hyp 組比較，▲P＜0.05]

本研究重點(diǎn)探討了金絲桃苷在大鼠SAH后EBI中的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)及其相關(guān)機(jī)制，主要發(fā)現(xiàn)有以下3點(diǎn)：（1）金絲桃苷能夠減輕SAH后的腦水腫、減少血腦屏障破壞并改善神經(jīng)功能；（2）金絲桃苷能顯著下調(diào)SAH后的炎癥反應(yīng)；（3）金絲桃苷在SAH后的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)與Akt/GSK-3β信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，金絲桃苷治療可以激活A(yù)kt/GSK-3β相關(guān)的抗炎信號(hào)通路，減輕SAH后的腦水腫和血腦屏障破壞，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。金絲桃苷及其介導(dǎo)的Akt/GSK-3β信號(hào)通路有望成為治療SAH的潛在靶點(diǎn)。