■張慶華 趙新海 鐘麗娟 關(guān)艷麗 郝 捷 方 新

（1.遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧朝陽122000；2.內(nèi)蒙古昆明卷煙有限責(zé)任公司，內(nèi)蒙古呼和浩特010020）

隨著畜牧業(yè)的發(fā)展，我國飼料資源日益緊缺，開發(fā)地源性非常規(guī)飼料資源成為重要途徑之一[1]。同時隨著我國人民的生活水平日益提高，飲食結(jié)構(gòu)逐漸改變，對食用菌的需求量逐年增加，使得食用菌產(chǎn)業(yè)飛速發(fā)展，每年約可產(chǎn)生5 800萬噸的菌糠[2]。菌糠是食用菌生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的廢棄物，雖然營養(yǎng)價值豐富，但產(chǎn)區(qū)分布具有地域性，應(yīng)用少且飼用價值不明確，因此被歸類為非常規(guī)飼料。菌糠含有豐富的纖維素、粗蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)，菌糠資源二次利用的研究越來越受關(guān)注。大量研究表明，利用微生物發(fā)酵菌糠的研究多集中在制備動物蛋白飼料方面[3]，利用金針菇菌糠制備飼用復(fù)合酶制劑的研究較少，針對金針菇的營養(yǎng)成分特點，本研究利用兩株黑曲霉和一株米曲霉復(fù)合發(fā)酵金針菇菌糠，生產(chǎn)富含纖維素酶、木聚糖酶和中性蛋白酶的復(fù)合酶制劑，有效改善了單一菌種酶系單一、酶活力低的弊病。同時米曲霉和黑曲霉作為活菌制劑[4]，有助于促進(jìn)動物腸道乳酸菌菌群的生長，減少動物糞便排泄物中大腸桿菌的數(shù)量，從而有利于動物的健康成長。將該酶制劑用于肉雞飼喂試驗，肉雞采食量、日增重、飼糧利用率等指標(biāo)和對照組相比，差異顯著，獲得了較理想的飼喂效果，為菌糠和酶制劑的開發(fā)利用奠定了良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種、培養(yǎng)基及試驗動物

黑曲霉(LW-9)、黑 曲霉(LW-08)、米曲霉(GY-2018-0038)為實驗室保存菌種。

斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基；豆汁培養(yǎng)基。

混合發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：金針菇菌糠∶麩皮∶豆餅粉=60∶40∶5（金針菇栽培配方：麩皮25%，玉米芯73%，石膏1%,蔗糖1%）。

試驗動物為AA商品代肉雞。

1.2 混菌培養(yǎng)及其條件優(yōu)化

菌種孢子懸液制備：將在PDA 斜面上培養(yǎng)4～5 d黑曲霉菌株和豆汁斜面培養(yǎng)4～5 d的米曲霉分別制成孢子數(shù)1.0×109個/l的孢子懸液。

混菌培養(yǎng)及其條件優(yōu)化：采用單因子試驗和響應(yīng)面法對培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。每500 ml 三角瓶裝干料20 g，混合菌種接種量10%，通過改變菌糠與麩皮的質(zhì)量比、無機(jī)鹽的添加量、豆粕添加量、三菌種的比例、培養(yǎng)時間等確定最優(yōu)培養(yǎng)基和發(fā)酵條件。

1.3 酶活力測定

1.3.1 粗酶液制備

將發(fā)酵后的培養(yǎng)物于40 ℃烘干。稱取一定量的固體酶樣，按1∶10加水、40 ℃水浴搖床抽提30 min，用濾紙過濾，濾液即為粗酶液。依據(jù)發(fā)酵產(chǎn)物中纖維素酶、木聚糖酶和中性蛋白酶的酶活力大小進(jìn)行二次稀釋。

1.3.2 酶活力的測定

纖維素酶酶活力測定，按NY/T 912—2004方法測定；木聚糖酶酶活力按GB/T 23874—2009 方法測定；中性蛋白酶酶活力按GB/T 23527—2009方法測定。

1.4 動物飼喂試驗

取1日齡健康A(chǔ)A商品代肉雞368羽，按試驗要求分成2組，每組兩個重復(fù)，分別飼喂不含酶制劑（對照組）和含2 g/kg 酶制劑（酶制劑成分：纖維素酶活力2 549 U/g、木聚糖酶活力2 925 U/g 和中性蛋白酶的酶活6 679 U/g）的玉米-豆粕型日糧。日糧配方及營養(yǎng)水平見表1。試驗雞自由采食和飲水，試驗期42 d。分別于1日齡和42日齡時稱重以計算增重。每日記錄耗料量、剩料量和死逃雞只數(shù)，并對死逃雞稱重。

料重比=平均日采食量（g）/平均日增重（g）

表1 日糧配方組成及營養(yǎng)水平

1.5 試驗設(shè)計和數(shù)據(jù)統(tǒng)計

運(yùn)用DESIGN EXPERT和SAS軟件進(jìn)行試驗設(shè)計和數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以纖維素酶、木聚糖酶和中性蛋白酶為響應(yīng)值，通過Design-Expert 10.0.3軟件設(shè)計Box-Behnken 響應(yīng)面試驗。因素水平如表2所示。對纖維素酶、木聚糖酶和中性蛋白酶進(jìn)行二次多元回歸方程擬合，得到各因素與響應(yīng)值之間函數(shù)關(guān)系的回歸方程，根據(jù)生成響應(yīng)面圖確定最優(yōu)的產(chǎn)酶發(fā)酵條件。

表2 響應(yīng)面試驗的因素和水平

1.6 響應(yīng)面條件優(yōu)化驗證

按照Design-Expert10.0.3 軟件優(yōu)化得到混菌發(fā)酵最好的條件進(jìn)行發(fā)酵試驗，驗證該方程擬合度。

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)基中金針菇菌糠與麩皮的質(zhì)量比對復(fù)合酶酶活力的影響

固定產(chǎn)纖維素酶、木聚糖酶和中性蛋白酶菌種的接種比例為1∶1∶1，混合菌種接種量10%。在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，通過改變菌糠與麩皮的質(zhì)量比，確定其對復(fù)合酶酶活力的影響（見圖1）。結(jié)果表明，麩皮對絲狀真菌的產(chǎn)酶活性有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，隨著麩皮在培養(yǎng)基中添加量的增加，纖維素酶、木聚糖酶和中性蛋白酶的酶活力逐漸增加，菌糠與麩皮質(zhì)量比在6∶4 時，纖維素酶活力和木聚糖酶活力皆達(dá)到最大值，纖維素酶活力為3 046 U/g,木聚糖酶活力2 612 U/g；菌糠與麩皮的質(zhì)量比在5∶5 和4∶6 時，中性蛋白酶活力達(dá)到最大值并趨于穩(wěn)定。以中性蛋白酶酶活性為主，兼顧考慮纖維素酶和木聚糖酶酶活力，確定菌糠與麩皮質(zhì)量最佳比為6∶4，三種酶的活力分別為3 046、2 612 U/g和5 905 U/g。

圖1 金針菇菌糠與麩皮的質(zhì)量比對復(fù)合酶酶活力的影響

2.2 豆粕添加量對復(fù)合酶酶活力的影響

在培養(yǎng)基中增加豆粕粉，為絲狀真菌的生長提供有機(jī)氮源，有助于菌絲的生長[5]，但對三種酶的酶活力影響是不確定的。因此以培養(yǎng)基中菌糠與麩皮質(zhì)量比6∶4為基礎(chǔ)，固定產(chǎn)纖維素酶、木聚糖酶和中性蛋白酶菌種的接種比例為1∶1∶1，混合菌種接種量10%，其他因素不變，研究了豆粕粉添加量對混菌發(fā)酵復(fù)合酶酶活力的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可見，豆粕粉的添加對纖維素酶活力和木聚糖酶活力影響不大，沒有明顯的促進(jìn)和抑制作用。豆粕粉的添加對蛋白酶的活力有一定的促進(jìn)作用，添加量為5%時，酶活力最高，達(dá)到6 542 U/g，之后隨著豆粕粉的增加，中性蛋白酶活力逐漸下降，這可能與物料透氣性和豆粕中含有中性蛋白酶的抑制因子有關(guān)[6]。綜合三種酶的酶活力情況，豆粕粉的添加量為5%時，三種酶的酶活力分別為2 996、2 738 U/g和6 542 U/g。

2.3 無機(jī)鹽(NH4)2SO4和NaH2PO4添加量對復(fù)合酶酶活力的影響

以培養(yǎng)基中菌糠與麩皮質(zhì)量比6∶4為基礎(chǔ)，固定產(chǎn)纖維素酶、木聚糖酶和中性蛋白酶菌種的接種比例為1∶1∶1，混合菌種接種量10%，豆粕粉的添加量為5%，其他因素不變，確定無機(jī)鹽(NH4)2SO4和NaH2PO4添加量對復(fù)合酶酶活力的影響。每種酶都有自己的活性中心，無機(jī)鹽離子對酶活性的提高和酶的穩(wěn)定有較好的作用[7]。NaH2PO4對米曲霉中性蛋白酶活力有顯著的促進(jìn)作用，(NH4)2SO4的作用不明顯。(NH4)2SO4對纖維素酶活力和木聚糖酶活力有促進(jìn)作用，NaH2PO4對兩株酶的酶活力無明顯促進(jìn)作用。通過試驗確定(NH4)2SO4和NaH2PO4的最適添加濃度，使混菌發(fā)酵的復(fù)合酶酶活力達(dá)到最優(yōu)比例，結(jié)果見圖3和圖4。以中性蛋白酶酶活力為主，兼顧考慮纖維素酶和木聚糖酶酶活力，當(dāng)NaH2PO4和(NH4)2SO4添加量為0.2%、0.6%時，三種酶均可以得到優(yōu)化，纖維素酶、木聚糖酶和中性蛋白酶的酶活力分別為3 025、2 876 U/g和6 533 U/g。

圖2 豆粕添加量對復(fù)合酶酶活力的影響

圖3 NaH2PO4添加量對復(fù)合酶酶活力的影響

圖4 (NH4)2SO4添加量對復(fù)合酶酶活力的影響

2.4 三菌種接種比例對固態(tài)混菌發(fā)酵復(fù)合酶酶活力的影響

單一菌發(fā)酵時接種量的大小影響發(fā)酵酶活力的大小和發(fā)酵周期，接種量小，延遲期長，發(fā)酵周期長，易染菌；接種量高使菌體生長快，代謝產(chǎn)物積累多，也會產(chǎn)生代謝抑制現(xiàn)象，最終影響酶的活力?；炀l(fā)酵生產(chǎn)飼用復(fù)合酶時，不同的菌種生長速度不同，所以三種菌不同的配比會對復(fù)合酶中三種酶的酶活力有影響[8-9]，結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，不同配比的菌種對復(fù)合酶中纖維素酶活力基本無影響，對木聚糖酶和中性蛋白酶酶活力有顯著的影響；當(dāng)配比為3∶3∶4時，木聚糖酶活性最高，酶活力為2 580 U/g。當(dāng)配比為2∶3∶5時中性蛋白酶活力最高，酶活力為6 011 U/g。以中性蛋白酶酶活力為主，兼顧考慮纖維素酶和木聚糖酶酶活力，選用三種菌種的合理配比為2∶3∶5時，三種酶的活力分別為2 805、2 549 U/g和6 011 U/g。

圖5 三菌種接種比例對固態(tài)混菌發(fā)酵復(fù)合酶酶活力的影響

2.5 培養(yǎng)時間對復(fù)合酶酶活力的影響

以培養(yǎng)基中菌糠與麩皮質(zhì)量比6∶4 為基礎(chǔ)，固定產(chǎn)纖維素酶、木聚糖酶和中性蛋白酶菌種的接種比例為2∶3∶5，混合菌種接種量10%，豆粕粉的添加量為5%，其他因素不變，確定培養(yǎng)時間對復(fù)合酶酶活力的影響。不同的單一酶都有最佳的發(fā)酵周期，三種菌同時培養(yǎng)，互相促進(jìn)，產(chǎn)酶的周期會發(fā)生變化[10-11]，混合菌種按最佳比例接種，研究了不同培養(yǎng)時間對復(fù)合酶酶活力的影響。從培養(yǎng)48 h起，每間隔8 h取樣一次，測定不同培養(yǎng)時間三種酶的酶活力，結(jié)果見圖6。結(jié)果表明，隨著發(fā)酵時間的延長，三種酶皆呈先上升后下降趨勢，纖維素酶和中性蛋白酶酶活力在72 h達(dá)到最大值，之后逐漸下降，蛋白酶較纖維素酶酶活力下降幅度大；木聚糖酶酶活力在80 h 達(dá)到最大，比72 h提高4%，提高幅度不大。以中性蛋白酶酶活力為主，兼顧考慮纖維素酶和木聚糖酶酶活力，選擇72 h為復(fù)合酶制劑的發(fā)酵周期，三種酶的酶活力分別為3 254、2 226 U/g和6 182 U/g。

圖6 培養(yǎng)時間對復(fù)合酶酶活力的影響

2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化混菌發(fā)酵試驗

2.6.1 模型建立及顯著性分析

利用Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化培養(yǎng)條件，根據(jù)單因素試驗結(jié)果，對菌糠∶麩皮的比例、豆粕的添加量和培養(yǎng)時間等三因素，以纖維素酶、木聚糖酶和中性蛋白酶酶活力為響應(yīng)值，通過Design-Expert 10.0.3軟件設(shè)計Box-Behnken響應(yīng)面試驗（見表3）。

該模型的決定系數(shù)R2=0.985 0，校正決定系數(shù)AdjR2=0.965 8，說明實際值和預(yù)測值擬合度比較好。由表4 以看出，該回歸模型P＜0.000 1，這表明此二次模型影響極顯著，失擬項的P=0.418 8＞0.05，模型失擬項影響不顯著，說明無失擬因素存在，表明該模型在統(tǒng)計學(xué)上是有意義的。模型中B、C、BC、A2、B2、C2的P＜0.01，表明這些項對復(fù)合酶酶活力的影響極顯著。A 的P＞0.05，表明對復(fù)合酶酶活力的影響不顯著。一次項B、C 對產(chǎn)纖維素酶影響達(dá)到極顯著水平，A 的影響不顯著(P＞0.05)。交互項中只有BC 的P＜0.05，說明其他交互作用對復(fù)合酶中纖維素酶無顯著性影響。

該模型的決定系數(shù)R2=0.985 1，校正決定系數(shù)AdjR2=0.966 0，說明實際值和預(yù)測值擬合度比較好。由表5 以看出，該回歸模型P＜0.000 1，這表明此二次模型影響極顯著，失擬項的P=0.434 5＞0.05，模型失擬項影響不顯著，說明無失擬因素存在，表明該模型在統(tǒng)計學(xué)上是有意義的。模型中B、C、BC、A2、B2、C2的P＜0.01，表明這些項對復(fù)合酶酶活力的影響極顯著。一次項A、B、C 對產(chǎn)木聚糖酶影響達(dá)到顯著或極顯著水平。交互項中只有BC 的P＜0.05，說明其他交互作用對復(fù)合酶中木聚糖酶無顯著性影響。

表4 R1方差分析

表5 R2方差分析

該模型的決定系數(shù)R2=0.985 3，校正決定系數(shù)AdjR2=0.966 4，說明實際值和預(yù)測值擬合度比較好。由表6 以看出，該回歸模型P＜0.000 1，這表明此二次模型極顯著，失擬項的P=0.439 6＞0.05，模型失擬項不顯著，說明無失擬因素存在，表明該模型在統(tǒng)計學(xué)上是有意義的。模型中B、C、BC、A2、B2、C2的P＜0.01，表明這些項對復(fù)合酶酶活性的影響極顯著。一次項A、B、C 對產(chǎn)中性蛋白酶影響達(dá)到極顯著水平。交互項中只有BC 的P＜0.05，說明其他交互作用對復(fù)合酶中的中性蛋白酶無顯著性影響。

2.6.2 響應(yīng)面交互作用分析通過Design-Expert10.0.3 軟件，得到兩因素交互作用的3D響應(yīng)面曲線圖。等高線的形狀可反映出交互作用的強(qiáng)弱，橢圓形代表兩因素交互作用顯著，圓形則相反。由圖7、圖8、圖9 可知BC 交互作用顯著，AC、AB 交互作用不顯著，均與表3、表4、表5 方差分析結(jié)果一致，并且響應(yīng)面曲面開口向下，存在最大值，說明最佳點在考察的區(qū)域內(nèi)。最后得到的優(yōu)化培養(yǎng)條件為，菌糠∶麩皮的比例為1∶0.776，豆粕添加量為5.314%，培養(yǎng)時間為70.255 h,此時預(yù)測纖維素酶活力、木聚糖酶活力和中性蛋白酶的酶活力達(dá)到均衡，分別為2 587、2 974 U/g和6 726 U/g。

表6 R3方差分析

圖7 三因素對纖維素酶酶活力響應(yīng)面

圖8 三因素對木聚糖酶酶活力響應(yīng)面

圖9 三因素對中性蛋白酶酶活力響應(yīng)面

2.6.3 最優(yōu)培養(yǎng)條件的驗證試驗

為方便實際操作，將2.6.2 發(fā)酵條件調(diào)整為，菌糠∶麩皮的比例為1∶0.77，豆粕添加量為5.3%，培養(yǎng)時間為70.2 h，按此條件進(jìn)行試驗，重復(fù)3次取平均值，測得三種酶的酶活力分別為2 549、2 925、6 679 U/g，與預(yù)測值的相對誤差分別1.47%、1.65%和0.70%，說明模型能夠有效反映各篩選因素對響應(yīng)值的影響，具有實用價值。

2.7 復(fù)合酶飼喂試驗效果分析

以本研究的粗酶制劑產(chǎn)品進(jìn)行了動物飼喂試驗研究。結(jié)果見表7和表8。

表7 復(fù)合酶制劑對肉雞體重和平均日增重的影響

表8 復(fù)合酶制劑對肉雞平均日采食量和料重比的影響

結(jié)果表明，試驗組雞只在42 日齡體重和平均日增重均高于對照組，料重比顯著低于對照組，差異顯著(P＜0.05)，該復(fù)合酶制劑具有酶系全、酶活高,尤其是蛋白酶活高的特點,在動物日糧中添加,可給動物直接補(bǔ)充飼料消化酶和非淀粉多糖酶,提高飼料分解率，增加動物吸收效果，從而提高飼料轉(zhuǎn)化率,降低料重比,動物增重作用明顯。

3 結(jié)果與討論

通過響應(yīng)面法和驗證試驗得到的結(jié)果，纖維素酶、木聚糖酶酶活力和中性蛋白酶酶活力分別為2 587、2 974 U/g 和6 726 U/g。結(jié)果表明，纖維素酶酶活力低于單因素實驗中的酶活力，單因素實驗中纖維素酶的平均酶活力為3 025 U/g。這可能是菌糠在配方中所占比例減小引起的。單因素試驗表明，菌糠的添加量對纖維素酶的酶活力有較大的影響，兩者比例為6∶4時，纖維素酶酶活力較高，可以達(dá)到3 000 U/g以上，而響應(yīng)面得到的比例為1∶0.77，造成了纖維素酶酶活力偏低，但也符合以中性蛋白酶酶活力為主，兼顧考慮纖維素酶和木聚糖酶酶活力的篩選原則。在實際生產(chǎn)中，可以根據(jù)產(chǎn)品對酶活力的需求，適當(dāng)調(diào)整菌糠和麩皮的比例，達(dá)到所需酶活力的范圍。

本研究利用兩株黑曲霉和一株米曲霉復(fù)合發(fā)酵金針菇菌糠，生產(chǎn)富含纖維素酶、木聚糖酶和中性蛋白酶的復(fù)合酶制劑，飼喂時不需要再復(fù)配，簡化了操作步驟，有效改善了單一菌種酶系單一、酶活力低的弊病。同時米曲霉菌和黑曲霉菌還可作為活菌制劑，有助于促進(jìn)動物腸道乳酸菌菌群的生長，減少動物糞便排泄物中大腸桿菌的數(shù)量，從而有利于動物的健康成長。飼喂試驗結(jié)果表明，試驗組雞只在42 日齡體重和平均日增重均高于對照組，料重比低于對照組，差異顯著(P＜0.05)。研究結(jié)果表明，金針菇菌糠含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，是一個良好的飼用酶制劑生產(chǎn)原料，本研究解決了其被大量丟棄造成的環(huán)境污染，降低了生產(chǎn)成本，增加了經(jīng)濟(jì)效益，為菌糠和酶制劑的開發(fā)利用奠定了良好基礎(chǔ)。

本研究表明，黑曲霉和米曲霉有較好的共生性，獲得了較高酶活力的飼用復(fù)合酶制劑。通過單因素實驗和響應(yīng)面法，確定了三種絲狀真菌復(fù)合發(fā)酵金針菇菌糠生產(chǎn)飼用復(fù)合酶制劑的培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件。結(jié)果表明，三菌種的最佳合理配比為2∶3∶5，(NH4)2SO4添加量為0.6%、NaH2PO4添加量為0.2%，菌糠∶麩皮的比例為1∶0.77，豆粕添加量為5.3%，培養(yǎng)時間為70.2 h，三種酶的酶活分別為2 549、2 925、6 679 U/g。