■袁國尚 張安青 姚 麗 何柯微 姜海波，4 文 明 邵 儉 林艷紅，4*

（1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴州大學(xué)特種水產(chǎn)研究所，貴州貴陽550025；3.銅仁市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局漁業(yè)技術(shù)推廣站，貴州銅仁554300；4.貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，貴州貴陽550025；5.貴州省動物生物制品工程技術(shù)研究中心，貴州貴陽550025）

鱘魚是我國重要的亞冷水性經(jīng)濟魚類，其肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)價值高。當(dāng)前全球鱘形目魚類共有27種，在我國自然生存的鱘魚有8種[1]。近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，養(yǎng)殖產(chǎn)量迅猛增加，至2017 年我國鱘魚產(chǎn)量已達83 058 t[2]。然而，疾病頻發(fā)卻成為影響鱘魚養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素之一，尤其以細菌性疾病的危害最為普遍和嚴重。使用抗生素防治細菌性疾病已然常態(tài)化。但長期使用抗生素類藥物，不僅污染養(yǎng)殖水體，而且會導(dǎo)致致病菌產(chǎn)生耐藥性，魚體藥物殘留超標，進而影響水產(chǎn)品的食用安全性[3]，因此尋找抗生素替代品成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重要研究方向。中草藥不僅具有抑菌、抗菌的效果，而且具備來源廣泛、價格低廉、毒副作用小、藥物殘留少、無耐藥性等特點，因此備受養(yǎng)殖企業(yè)和科研人員的關(guān)注。

海豚鏈球菌屬于芽孢桿菌綱、乳桿菌目、鏈球菌科、鏈球菌屬，為革蘭氏陽性菌，廣泛分布于水環(huán)境、土壤和食物中[4]。該菌感染宿主廣、致病力強，給水產(chǎn)、禽類以及人類健康帶來嚴重危害[5]。已有研究報道虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[6]、羅非魚（Oreochromis niloticus）[5]、斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）[7]等養(yǎng)殖魚類感染海豚鏈球菌，并導(dǎo)致嚴重的經(jīng)濟損失。相關(guān)研究表明，黃連、黃芩、大黃、黃柏、博落回、五倍子和石榴皮等中草藥單劑對羅非魚源海豚鏈球菌具有較強的抑菌效果[8-10]。目前，針對海豚鏈球菌的相關(guān)報道集中于單味中草藥的體外抑菌效果研究，而關(guān)于復(fù)方中草藥尚未見報道。復(fù)方中草藥是基于治法與藥物性能，以有效、安全為目的，較單味中草藥具有加強藥物的功效；擴大治療范圍，適應(yīng)較為復(fù)雜的病情；引導(dǎo)多功效單味中草藥的作用方向；減輕或消除藥物的不良反應(yīng)；形成新的功能等特點[11]。鑒于此，本試驗選取九味羌活湯等10 種復(fù)方中草藥，研究其對鱘源海豚鏈球菌的體外抑菌作用，以期為防治鱘源海豚鏈球菌誘發(fā)的疾病提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

鱘源海豚鏈球菌為北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站分離鑒定和保存提供。

1.2 試驗藥物

選取九味羌活湯、桑菊飲、養(yǎng)陰清肺湯、八正散、五苓散、大青龍湯、槐花散、藿香正氣散、麻黃杏仁甘草石膏湯和痰飲丸10 種具有抗菌、消炎等功效的復(fù)方中草藥為研究對象，試驗前將10 種復(fù)方中的全部單味中草藥分別粉碎后過60目篩，干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 中草藥復(fù)方組合及藥液制備

根據(jù)《方劑學(xué)》[11]按照比例組合成10 種復(fù)方中草藥(見表1)，用水提法制備藥液，取10種不同的復(fù)方中草藥稱重，加入5～10倍蒸餾水浸泡1 h，武火煮沸后，文火熬制30 min，8層紗布過濾，收集濾液，重復(fù)3次，合并3 次濾液進行濃縮，使終濃度為1 000 mg/ml，離心后，取上清液121 ℃高壓滅菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 復(fù)方中草藥組合

1.4 菌懸液的制備

取保藏菌種，接種血平板，28 ℃培養(yǎng)24 h。挑取單菌落于TSB 液體試管中進行搖床培養(yǎng)24 h（28 ℃，140 r/min），調(diào)整菌液濃度為2×108～3×108CFU/ml，用于后續(xù)試驗。

1.5 中草藥平板抑菌試驗

采用牛津杯法[9]，即在無菌條件下，用直徑9 cm培養(yǎng)皿，將其平均分成3 個區(qū)域，分別在固定位置放入高為（10±0.1）mm、外徑為（8±0.1）mm、內(nèi)徑為（6±0.1）mm的3只牛津杯內(nèi)，并排列呈正三邊形，保持相鄰兩孔的距離大于3 cm，以免相鄰的抑菌圈重疊而影響測量準確性。待滅菌培養(yǎng)基冷卻至50 ℃時倒入平板（30 ml/個），凝固后取出牛津杯，做好標記。各孔分別加入100 μl海豚鏈球菌菌液，用無菌玻璃涂布棒涂抹均勻，試驗組分別在孔洞里加入100 μl 相應(yīng)的藥液，每種藥液設(shè)置3 個平行，設(shè)置陽性對照（涂菌，打孔，添加強力霉素）和空白對照（涂菌，打孔，加雙蒸餾水），將平皿在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑。每孔取不同方向測量2 次，最終求取3 個平板共6次測量結(jié)果的平均值，以代表該種藥液抑菌效果。判斷標準：抑菌圈直徑0～10 mm 為低度敏感（-），10～20 mm 為中度敏感（+），＞20 mm 為高度感（++）[10]。

1.6 最小抑菌質(zhì)量濃度（Minimum Inhibitory Concen-tration，MIC）

采用二倍稀釋法[12]，取13 支無菌帶棉塞的試管（15×150）進行編號（1～13 號）后置于試管架上，首先在1～11號試管加入2.5 ml液體培養(yǎng)基；其次在1號試管中加入2.5 ml原藥液混勻，隨后從1號中吸取2.5 ml加入2號試管，依次吸取2.5 ml混合液加入后面編號的各試管中直至11 號試管，然后再從11 號試管吸取2.5 ml丟棄；最后在1～11號試管中各加入100 μl菌液搖勻，12號試管加菌液不加藥液作為生長對照，13號試管號加藥液不加菌液作空白對照。每種中草藥重復(fù)3次，最后放置28 ℃的震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；培養(yǎng)結(jié)束后觀察1～13號試管內(nèi)的細菌生長情況，其中無菌生長的最高稀釋濃度即為最小抑菌濃度（MIC）。

1.7 最小殺菌質(zhì)量濃度的測定（Minimum Bactericidal Concentration，MBC）

在MIC 試驗基礎(chǔ)上繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果，清澈透明無混濁現(xiàn)象的試管即為無菌生長試管。無菌生長試管中的最低藥物質(zhì)量濃度為最小殺菌質(zhì)量濃度（MBC）。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0 對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以“平均值±標準差（Mean±SD.）”表示。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方中草藥的抑菌圈測定（見表2）

表2 10種復(fù)方中草藥對海豚鏈球菌的體外抑菌活性

由表2可知，鱘源海豚鏈球菌對九味羌活湯和桑菊飲水提物高度敏感，抑菌圈直徑分別為（24.08±3.92）mm和（23.92±2.34）mm；養(yǎng)陰清肺湯、八正散、五苓散和大青龍湯的抑菌圈直徑分別為（17.74±0.83）、（13.83±0.89）、（12.02±1.42）mm 和（10.26±0.96）mm，屬于中度敏感。鱘源海豚鏈球菌對槐花散、藿香正氣散、麻黃杏仁甘草石膏湯和痰飲丸水提物低度敏感。

2.2 復(fù)方中草藥的MIC和MBC（見表3）

表3 復(fù)方中草藥對海豚鏈球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度（mg/ml）

由表3 可知，九味羌活湯和桑菊飲的MIC 均為62.5 mg/ml，MBC均為125 mg/ml。養(yǎng)陰清肺湯的MIC和MBC 分別為125、250 mg/ml。八正散、五苓散和大青龍湯的MIC均為250 mg/ml，MBC均為500 mg/ml。

3 討論

鏈球菌是一種廣泛分布自然界的革蘭氏陽性菌[13]，其中海豚鏈球菌作為重要的病原菌，具有感染宿主廣、傳染性強、死亡率高的特點，可對海水、半咸水和淡水的30 多種養(yǎng)殖或野生魚類進行感染，嚴重危害水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，并每年對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成的經(jīng)濟損失超過100 億美元[14]。相關(guān)研究表明，中草藥對細菌性疾病的防治有積極的效果，中草藥通過多靶點機制抑制病原菌生長或殺死病原，常見的作用機制為中草藥及其有效成分通過抑制病原菌肽聚糖及細胞壁的合成，使細胞壁裂解；抑制菌體蛋白質(zhì)的合成使細菌死亡；干擾菌體的酶系，抑制酶的活性，使菌體的新陳代謝發(fā)生紊亂而死亡；抑制細菌的呼吸代謝，使病原菌無法完成正常的呼吸代謝而死亡[15]。本研究中，鱘源海豚鏈球菌對九味羌活湯和桑菊飲高度敏感，抑菌圈直徑分別達到了(24.08±3.92)、(23.92±2.34) mm，兩味復(fù)方的MIC 值均為62.5 mg/ml，MBC 值均為125 mg/ml，這表明九味羌活湯和桑菊飲對鱘源海豚鏈球菌具有較好的抑菌、殺菌效果。九味羌活湯和桑菊飲分別是辛溫解表劑和辛涼解表劑的代表方，對流行性感冒、大葉性肺炎、急性扁桃體炎等疾病有良效。有研究表明，這兩種方劑的水煎劑具有較好的抗菌作用。高靈玲等[16]開展了九味羌活湯水煎劑對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、普通變形桿菌、福氏志賀氏菌、微球菌進行體外抑菌實驗，結(jié)果顯示該水煎劑的MIC分別為8、16、31、63、16 mg/ml。盧芳國等[17]報道，桑菊飲對金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌、大腸埃希菌的MIC 分別為62.5、125、62.5 mg/ml，MBC 分別為62.5、125、250 mg/ml。吳穎瑞等[8]研究表明，羅非魚源海豚鏈球菌對羌活低度敏感，而黃芩、連翹、白芷、倉術(shù)對羅非魚海豚鏈球菌無抑菌效果。羌活、黃芩、連翹、白芷、倉術(shù)是九味羌活湯或桑菊飲中的組分，與單味藥體外抑菌效果相比，九味羌活湯和桑菊飲抑菌效果均強于組方中的單味中草藥。鄧凱偉等[18]在對奶牛隱性乳腺炎金黃色葡萄球菌、沙雷氏菌的體外抑菌試驗也得出相同的結(jié)論。組成一首方劑既不是將某些功效類似藥物的堆砌相加，也不是簡單地“對號入座”，而是遵循一定原則即君、臣、佐、使。藥物通過合理的配伍組成方劑，可以增強或改變其原來的功用，并調(diào)其偏勝，制其毒性，消除或緩解其對機體不良反應(yīng)，發(fā)揮藥物間相輔相成或相反相成等綜合作用，使各具特性的藥物組合成一個整體，從而發(fā)揮更好的預(yù)防與治療效果[11]。

本研究中養(yǎng)陰清肺湯、八正散、大青龍湯和五苓散對鱘源海豚鏈球菌均表現(xiàn)出較好的抑菌效果，抑菌圈直徑在10.26～17.74 mm 之間。養(yǎng)陰清肺湯屬滋陰潤燥類方劑，具有良好的養(yǎng)陰、清肺、解毒、抑菌作用。陳國清等[19]報道，養(yǎng)陰清肺湯對白喉桿菌有高度抗菌作用，對白喉毒素在體外有很高的“中和能力”。本方8 味藥物，抗菌力較強的有生地、牡丹皮、甘草，“中和”毒素能力較強的有玄參、麥冬、貝母，白芍兩方面能力均強，薄荷則均較差；但從原方中減去任何1 味藥，抗菌作用都會降低。八正散屬清熱祛濕方劑，許健鵬等[20]研究發(fā)現(xiàn)八正散水煎劑對金黃色葡萄球菌、福氏痢疾桿菌、甲型付傷寒桿菌具有較強的殺菌效果，殺菌濃度分別為15.625、62.5、62.5 mg/ml。大青龍湯屬于辛溫解表，具有解熱、抑菌的功能[21]，對葡萄球菌和大腸桿菌有一定的體外抑菌作用，抑菌半徑均為13 mm[22]。五苓散屬利水滲濕方劑，主治蓄水證、腹瀉、霍亂等病癥。羅永江等[23]研究發(fā)現(xiàn)，五苓散可以促進植物血凝素刺激淋巴細胞轉(zhuǎn)化，增強細胞免疫功能，但五苓散對大腸桿菌的抑菌圈直徑僅為7.34 mm，表明大腸桿菌對五苓散低度敏感。而本研究中五苓散對鱘源海豚鏈球菌的抑菌圈直徑為(13.83±0.89) mm，屬中度敏感。研究結(jié)果存在差異，可能與供試菌株、供試藥劑產(chǎn)地與采摘時間、藥液制備方法、供試藥液濃度等方面不同有關(guān)。

4 結(jié)論

在本試驗條件下，篩選出九味羌活湯和桑菊飲2種復(fù)方中草藥對鱘源海豚鏈球菌具有較好的抑菌、殺菌效果。但其對病原菌的抑菌機理目前尚未明了，有待于進一步證實，同時其實際臨床應(yīng)用療效有待于進一步通過動物體內(nèi)試驗加以比較、驗證。