(西華大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 成都 610039)

溴氰菊酯(Deltamethrin)，又名“敵殺死”，是目前擬除蟲菊酯類殺蟲劑中用量增長(zhǎng)最快的殺蟲劑之一[1]，也是其中毒力最高的一種。溴氰菊酯在殺滅害蟲方面具有廣譜、高效等特點(diǎn)，所以廣泛用于農(nóng)業(yè)滅害、衛(wèi)生除蟲等方面[2]；但其在農(nóng)業(yè)或環(huán)境中的長(zhǎng)期廣泛施用易造成在農(nóng)產(chǎn)品或土壤中的蓄積及殘留[3-4]，因此，消除或減少溴氰菊酯農(nóng)藥在環(huán)境及農(nóng)產(chǎn)品中的殘留非常有必要。由于利用微生物降解農(nóng)藥殘留具有安全、高效、無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)[5-6]，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥尤其是溴氰菊酯的生物降解特性因而成為研究熱點(diǎn)。目前，已分離得到的溴氰菊酯降解菌有熒光假單胞菌(P.Fluorescens)、普成沙雷氏菌(Serratiaplymuthica)、產(chǎn)堿桿菌(Alcedinidae)等[7-10]。本研究以長(zhǎng)期施用溴氰菊酯的茶園土壤作為菌源，分離馴化得到一株能有效降解溴氰菊酯的菌株DXQ018，通過(guò)生理生化和16S rDNA分析進(jìn)行菌株鑒定，并對(duì)菌株DXQ018降解溴氰菊酯的特性進(jìn)行研究。研究結(jié)果豐富了溴氰菊酯降解菌資源庫(kù)，同時(shí)為進(jìn)一步研究其降解機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌源

以長(zhǎng)期施用溴氰菊酯農(nóng)藥的茶園土壤作為菌源。

1.1.2 試劑

溴氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.7%，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心)，溴氰菊酯原農(nóng)藥(質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.8%，南京榮誠(chéng)化工公司)，乙腈(色譜純，Adamas試劑公司)，溶菌酶、Bacteria DNA Kit提取試劑盒等(天根生化科技有限公司)，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 農(nóng)藥母液

用無(wú)水乙醇將一定量的溴氰菊酯原農(nóng)藥溶解并定容至質(zhì)量濃度為10 g/L的溶液。

1.1.4 儀器

Waters高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)，MyCycler PCR儀，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-RAD)，PowerPac Basic電泳儀。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(MM)[11]

KH2PO40.5 g，K2HPO41.5 g，NaCl 0.5 g，(NH4)2SO41.5 g，MgSO40.2 g，蒸餾水 1 000 mL，添加適量溴氰菊酯母液至所需濃度，pH 7.5，121 ℃滅菌15 min，添加1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂粉為對(duì)應(yīng)固體培養(yǎng)基。

1.2.2 LB培養(yǎng)基[11]

酵母膏5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，氯化鈉 10.0 g，蒸餾水1 000 mL，添加適量溴氰菊酯母液至所需濃度，pH 7.0，121 ℃滅菌15 min，添加1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂粉為對(duì)應(yīng)固體培養(yǎng)基。

1.3 降解菌的分離與篩選

1.3.1 降解菌的分離

取5.0 g菌源土樣加入分別含100 mg/L溴氰菊酯的MM和LB培養(yǎng)基中(三角瓶裝液量為20 mL/100 mL)30 ℃恒溫振蕩(180 r/min)培養(yǎng)5 d。按5.0%(體積分?jǐn)?shù))的比例，將培養(yǎng)液接入溴氰菊酯質(zhì)量濃度為200 mg/L的MM或LB培養(yǎng)基中恒溫振蕩(30℃，180 r/min)培養(yǎng)5 d。重復(fù)前述操作，順次于含400、600 mg/L溴氰菊酯的同類型培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)。取最末級(jí)培養(yǎng)液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，于MM和LB平板上(溴氰菊酯質(zhì)量濃度為100 mg/L)涂布，恒溫(30 ℃)培養(yǎng)3 d后挑取單菌落進(jìn)行劃線分離直至得到單菌落，將得到的純化菌株用甘油于-80 ℃冷凍保存。

1.3.2 降解菌的篩選

降解體系中溴氰菊酯的殘留量通過(guò)HPLC法檢測(cè)，空白對(duì)照為添加同濃度溴氰菊酯未接菌的培養(yǎng)液，通過(guò)計(jì)算溴氰菊酯的降解率，篩選得到對(duì)其有降解作用的菌株。

降解率/%= [(x0-x1)/x0]×100

(1)

式中:x0為空白對(duì)照中溴氰菊酯質(zhì)量濃度(μg/mL)；x1為降解體系中溴氰菊酯殘質(zhì)量濃度(μg/mL)。

1.4 降解菌的鑒定

理想降解菌株的形態(tài)學(xué)和生理生化特征參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行檢測(cè)[12]；其16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析參照文獻(xiàn)[11]方法進(jìn)行，菌株系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建采用MEGA 4.0軟件。

1.5 溴氰菊酯的檢測(cè)

樣品前處理參照文獻(xiàn)[13]方法進(jìn)行，樣品檢測(cè)采用HPLC；色譜條件為[11]：Comatex C18柱(5.0 μm，150 mm×4.60 mm)，流動(dòng)相為乙腈-超純水(85∶15，V/V)，流速為1.1 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，進(jìn)樣量為10 μL。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=9 664.6X-5 186.1(R2=0.999 9)計(jì)算溴氰菊酯的降解率。

1.6 理想降解菌株對(duì)溴氰菊酯的降解特性研究

1.6.1 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株降解溴氰菊酯能力的影響

取理想菌株的菌懸液(OD600=1.5)，以5%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種在溴氰菊酯質(zhì)量濃度為20 mg/L的LB培養(yǎng)基中，采用不同培養(yǎng)溫度(28、30、35、37、40 ℃)恒溫?fù)u床(180 r/min)培養(yǎng)3 d，以不接菌的空白培養(yǎng)基作對(duì)照；通過(guò)檢測(cè)菌株的生長(zhǎng)量OD600和溴氰菊酯的降解率，以考察培養(yǎng)溫度對(duì)其降解能力的影響。

1.6.2 培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌株降解溴氰菊酯能力的影響

調(diào)節(jié)LB培養(yǎng)基初始pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，取理想菌株的菌懸液(OD600=1.5)，以5%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種在溴氰菊酯質(zhì)量濃度為20 mg/L的LB培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫?fù)u床(180 r/min)培養(yǎng)3 d，以不接菌的空白培養(yǎng)基做對(duì)照；檢測(cè)培養(yǎng)終點(diǎn)降解體系中菌株生長(zhǎng)量OD600及溴氰菊酯降解率。

1.6.3 不同底物質(zhì)量濃度對(duì)菌株降解溴氰菊酯能力的影響

取理想菌株的菌懸液(OD600=1.5)，以5%(體積分?jǐn)?shù))的接種量分別接種到溴氰菊酯質(zhì)量濃度為10、20、40、50、100、200 mg/L的LB降解體系中，37 ℃恒溫?fù)u床(180 r/min)培養(yǎng)3 d，以不接菌的空白培養(yǎng)基作對(duì)照；檢測(cè)培養(yǎng)終點(diǎn)降解體系中菌株生長(zhǎng)量OD600及溴氰菊酯降解率。

2 結(jié)果與討論

2.1 降解菌的形態(tài)及生理生化特性

通過(guò)溴氰菊酯降解率的測(cè)定，從經(jīng)富集馴化后的菌源微生物中篩選得到8株對(duì)其有較高耐受性且有一定降解作用的菌株，其中菌株DXQ018對(duì)MM和LB降解體系中20 mg/L溴氰菊酯的降解率在培養(yǎng)5 d后分別達(dá)到28.7%和49.6%。該菌株的菌落表面光滑、濕潤(rùn)、不透明，邊緣較整齊，菌落突起呈白色。菌株DXQ018的生理生化特征如表1所示。

表1 菌株DXQ018 的生理生化特征

注：“+”為陽(yáng)性；“-”為陰性。

2.2 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

將菌株DXQ018經(jīng)PCR擴(kuò)增的16S rDNA片段提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，經(jīng)BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該菌株的16S rDNA與醋酸鈣不動(dòng)桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)相似度達(dá)99%以上，選取Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中與菌株DXQ018的16S rDNA基因序列相似性較高菌株的序列，采用鄰近法構(gòu)建菌株DXQ018的系統(tǒng)發(fā)育樹(如圖1所示)，結(jié)合菌株形態(tài)學(xué)及其生理生化特征將其鑒定為醋酸鈣不動(dòng)桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)。醋酸鈣不動(dòng)桿菌多被報(bào)道為苯酚等芳香族化合物的降解菌[14-15]；劉婷婷等[16]篩選到一株醋酸鈣不動(dòng)桿菌S8可高效降解聯(lián)苯菊酯；實(shí)驗(yàn)篩選得到的醋酸鈣不動(dòng)桿菌DXQ018是首次報(bào)道的可降解溴氰菊酯的不動(dòng)桿菌。

圖1 菌株DXQ018的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 醋酸鈣不動(dòng)桿菌DXQ018對(duì)溴氰菊酯的降解特性

2.3.1 醋酸鈣不動(dòng)桿菌DXQ018降解溴氰菊酯的適宜培養(yǎng)溫度

不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌株DXQ018降解溴氰菊酯的影響如圖2所示。由圖2可知，菌株DXQ018在不同培養(yǎng)溫度下的生長(zhǎng)量與溴氰菊酯的降解率基本成正比關(guān)系，即菌株生長(zhǎng)量最大時(shí)，溴氰菊酯的降解率最大。在28～40 ℃培養(yǎng)溫度范圍內(nèi)，溫度過(guò)低或過(guò)高均不利于菌株DXQ018的生長(zhǎng)，因而會(huì)影響其降解酶的分泌導(dǎo)致其降解率偏低；因此，當(dāng)培養(yǎng)溫度為37 ℃時(shí)，菌株DXQ018對(duì)溴氰菊酯的降解率最大為55.63%，此培養(yǎng)溫度是其適宜的培養(yǎng)溫度。

圖2 培養(yǎng)溫度對(duì)醋酸鈣不動(dòng)桿菌DXQ018降解溴氰菊酯的影響

2.3.2 醋酸鈣不動(dòng)桿菌DXQ018降解溴氰菊酯的適宜pH

培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌株DXQ018降解溴氰菊酯的影響如圖3所示。由圖可知，菌株DXQ018在不同pH環(huán)境中對(duì)溴氰菊酯的降解呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)。當(dāng)培養(yǎng)基初始pH偏酸(pH 3～4)或偏堿(pH 8～9)時(shí)，菌株DXQ018的生長(zhǎng)量和溴氰菊酯的降解率都偏低。菌株DXQ018較適宜的生長(zhǎng)pH范圍為5～7，而當(dāng)培養(yǎng)基初始pH為7時(shí)，菌株DXQ018的生長(zhǎng)量最大，同時(shí)溴氰菊酯的降解率最高為56.15%；因此，培養(yǎng)基初始pH 7是菌株DXQ018降解溴氰菊酯的適宜pH。

圖3 培養(yǎng)基初始pH對(duì)醋酸鈣不動(dòng)桿菌DXQ018降解溴氰菊酯的影響

2.3.3 醋酸鈣不動(dòng)桿菌降解溴氰菊酯的適宜底物質(zhì)量濃度

不同底物質(zhì)量濃度對(duì)菌株DXQ018降解溴氰菊酯的影響如圖4所示。由圖4可知，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為10～50 mg/L時(shí)，菌株DXQ018的生長(zhǎng)量差異不大；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為100 mg/L以上時(shí)，溴氰菊酯對(duì)菌株DXQ018的生長(zhǎng)表現(xiàn)出一定的抑制作用。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為20 mg/L時(shí)，菌株DXQ018對(duì)溴氰菊酯的降解率最高為58.27%。當(dāng)溴氰菊酯質(zhì)量濃度過(guò)低時(shí)，底物對(duì)菌株分泌降解酶的誘導(dǎo)能力不足，而過(guò)高的底物質(zhì)量濃度可能會(huì)對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用從而減少降解酶的分泌；因此，20 mg/L是菌株降解氯氰菊酯較適宜的底物質(zhì)量濃度。

圖4 底物質(zhì)量濃度對(duì)醋酸鈣不動(dòng)桿菌DXQ018降解溴氰菊酯的影響

3 結(jié)論

從茶園土壤中分離到一株能高效降解溴氰菊酯的菌株DXQ018，通過(guò)對(duì)菌株的形態(tài)、生理生化及16S rDNA特征進(jìn)行分析，將其鑒定為醋酸鈣不動(dòng)桿菌。菌株DXQ018在不同條件下表現(xiàn)出對(duì)溴氰菊酯不同的降解特性，培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基初始pH和底物質(zhì)量濃度對(duì)其降解溴氰菊酯表現(xiàn)出不同影響；實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，醋酸鈣不動(dòng)桿菌DXQ018降解溴氰菊酯的適宜培養(yǎng)溫度為37 ℃，適宜培養(yǎng)基初始pH為7，適宜底物質(zhì)量濃度為20 mg/L；在此條件下培養(yǎng)3 d，菌株DXQ018對(duì)溴氰菊酯的最高降解率達(dá)到58.27%；其降解效率高于已報(bào)道的溴氰菊酯降解菌陰溝腸桿菌X09[17]、熒光假單胞菌X20[17]和地衣芽孢桿菌qw5[18]，表明菌株DXQ018在未進(jìn)行條件優(yōu)化的情況下已具備較好的溴氰菊酯降解能力。

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