張華，王萌，劉琦，張亞男

赤峰市醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古 赤峰 024000

近年來(lái)由于環(huán)境惡化、吸煙人數(shù)增加等多因素影響，肺癌發(fā)生率逐年上升，病死率顯著提高，已經(jīng)成為全世界面臨的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題，肺腺癌盡早手術(shù)治療對(duì)提高患者生存率有積極意義[1]。腫瘤細(xì)胞有絲分裂異常頻繁，因此近年來(lái)抗腫瘤治療中已經(jīng)將微管作為靶點(diǎn)，Tubulin為微管主要蛋白成分，是微管作用藥物耐藥的唯一標(biāo)志物，國(guó)內(nèi)關(guān)于肺腺癌中β-Tubulin-Ⅲ表達(dá)情況及其與術(shù)前分期診斷的相關(guān)性研究鮮有報(bào)道[2]。鑒于此，本研究通過(guò)對(duì)60例肺腺癌患者的臨床資料進(jìn)行分析，以免疫組織化學(xué)法檢測(cè)β-Tubulin-Ⅲ在肺腺癌組織中的表達(dá)情況，并探討其與TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2010年3月至2019年3月赤峰市醫(yī)院收治的肺腺癌患者的病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：肺原發(fā)性腫瘤；有明確的病理診斷、影像學(xué)診斷；術(shù)中腫瘤切除完整；隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往腫瘤、克羅恩病、多原發(fā)腫瘤病史。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入肺腺癌患者60例，其中男38例，女22例；年齡20～78歲，平均（59.69±3.33）歲；不典型腺瘤樣增生（atypical adenomatous hyperplasia，AAH）14例，原位腺癌（adenocarcinoma in situ，AIS）15例，微浸潤(rùn)腺癌（minimally invasive adenocarcinoma，MIA）11例，浸潤(rùn)性腺癌（invasive adenocarcinoma，IA）20例。所有患者術(shù)前均接受肝腎功能、血常規(guī)、尿常規(guī)、凝血機(jī)制、肺功能及心電圖等常規(guī)檢查，存在手術(shù)適應(yīng)證，住院資料以醫(yī)院病案室存檔病歷資料為主，收集患者住院號(hào)、性別、診斷時(shí)年齡、病理結(jié)果、影像檢查結(jié)果、手術(shù)類型、手術(shù)日期、隨訪資料等。

1.2 檢測(cè)方法

β-Tubulin-Ⅲ檢測(cè)試劑由上海譜振生物科技有限公司提供，Eli Vision免疫組化試劑盒購(gòu)自福州邁新公司，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。以固定液對(duì)標(biāo)本實(shí)施固定處理，石蠟包埋；水化處理后行免疫組化染色。切片加入沸騰狀態(tài)的pH值為6.0的檸檬酸鹽緩沖液內(nèi)，觀察噴氣1 min后，由熱源轉(zhuǎn)移壓力鍋，室溫下放置20 min自然冷卻，水沖冷，將切片取出，水洗2 min。在切片中滴加3%過(guò)氧化氫孵育10 min，去除切片上的試劑，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）緩沖3 min，共3次；向切片中滴加抗體工作濃度，在室溫下孵育1 h，去除切片上的試劑，PBS緩沖5 min，共3次；切片內(nèi)滴加100 μl過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠聚合物（Max Vision）進(jìn)行檢測(cè)，室溫孵育15 min，去除試劑，PBS緩沖3 min，共3次；將新鮮配置的二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色液滴加在切片上，室溫孵育5 min，去除試劑，水洗2 min；蘇木素染液浸泡30 s，水洗，PBS返藍(lán)，梯度乙醇脫水，烤片，二甲苯透明，中性樹膠封固。采用10%鼠非免疫血清作為陰性對(duì)照。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 陽(yáng)性判定 采用免疫組織化學(xué)評(píng)分法評(píng)價(jià)。選取10個(gè)高倍視野計(jì)算陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞比例，1%～9%為0分，10%～49%為0.5分，＞50%為1分。同時(shí)依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)價(jià)，分為0、1、2、3分。二者相乘得分為最終得分，依據(jù)最終得分劃分為高表達(dá)、低表達(dá)[3]。

1.3.2 肺癌的TNM 分期 TNM分期是依據(jù)肺癌的發(fā)生部位、大小與擴(kuò)散程度進(jìn)行劃分。T：表示原發(fā)腫瘤；Tx：支氣管-肺分泌物中存在腫瘤細(xì)胞，X線檢查（-），纖維支氣管鏡也顯示為（-）；T0：不能明確原發(fā)病灶；T1：腫瘤大小不超過(guò)3 cm，且檢查無(wú)周圍轉(zhuǎn)移；T2：腫瘤大小超過(guò)3 cm，或向肺門部位擴(kuò)散，合并肺不張；T3：腫瘤累及縱隔、橫膈、胸膜，或與隆突的距離＜2 cm；T4：腫瘤侵及隆突、椎體、食管、大血管、心臟，或檢查顯示有胸腔積液。N：表示所屬淋巴結(jié)；N0：未出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；N1：同側(cè)肺門或支氣管周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；N2：同側(cè)隆突或縱隔處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；N3：對(duì)側(cè)縱隔或鎖骨、斜角肌上出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

1.3.3 浸潤(rùn)分布前沿區(qū) 腫瘤浸潤(rùn)前沿是處于腫瘤與宿主正常組織，或器官交界部位最前沿的3～6層腫瘤細(xì)胞。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，兩組比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同病理分型肺腺癌患者β-Tubulin-Ⅲ表達(dá)情況的比較

AAH、AIS及MIA肺腺癌組織中均基本無(wú)β-Tubulin-Ⅲ表達(dá)，IA肺腺癌組織中β-Tubulin-Ⅲ表達(dá)情況均優(yōu)于AAH、AIS及MIA，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.000、0.000、33.844，P＜0.05）。（表1）

表1 不同病理分型肺腺癌患者的β-Tubulin-Ⅲ表達(dá)情況（±s）

表1 不同病理分型肺腺癌患者的β-Tubulin-Ⅲ表達(dá)情況（±s）

病理分型AAH（n=14）AIS（n=15）MIA（n=11）IA（n=20）β-Tubulin-Ⅲ表達(dá)0 0 0.67±0.21 4.88±0.38

2.2 不同TNM 分期肺腺癌患者β-Tubulin-Ⅲ表達(dá)情況的比較

AAH非腫瘤病變，因此在進(jìn)行TNM分期統(tǒng)計(jì)時(shí)需剔除，因此參與本次數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)的患者共46例。T3～4期肺腺癌患者β-Tubulin-Ⅲ表達(dá)量高于 T1～2期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=21.780，P＜0.05）；N0～1期肺腺癌患者無(wú)β-Tubulin-Ⅲ陽(yáng)性表達(dá)，N3期肺腺癌患者β-Tubulin-Ⅲ表達(dá)量高于N2期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.808，P＜0.05）。（表2）

表2 不同TNM分期肺腺癌患者的β-Tubulin-Ⅲ表達(dá)情況（n =46）

2.3 β-Tubulin-Ⅲ陽(yáng)性細(xì)胞分布區(qū)分化情況

β-Tubulin-Ⅲ陽(yáng)性細(xì)胞浸潤(rùn)分布分為浸潤(rùn)分布前沿區(qū)、非前沿區(qū)；其中前沿區(qū)低分化25例，高分化10例；非前沿區(qū)低分化10例，高分化15例；前沿區(qū)、非前沿區(qū)分化情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.927，P＜0.05）。

3 討論

肺癌發(fā)病率、病死率的急劇上升，使其成為眾多學(xué)者、臨床研究關(guān)注的重點(diǎn)，然而由于臨床關(guān)于肺癌的發(fā)生、進(jìn)展機(jī)制了解尚不完全，因此有效的治療手段仍然未定論、相對(duì)缺乏，急需更深入的研究尋找新的靶點(diǎn)與方向。

不同階段肺腺癌的治療策略亦不相同，其中AAH、AIS只需要局部手術(shù)切除即可，而MIA需肺葉切除，IA患者多為中晚期、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，因此多為肺大部分切除+淋巴結(jié)清掃+術(shù)后放化療等[4]。雖然國(guó)際相關(guān)組織對(duì)肺腺癌進(jìn)行了組織學(xué)分類，然而在診斷、治療中，該分類方法的弊端如無(wú)法對(duì)腫瘤分子病理學(xué)、影像學(xué)新進(jìn)展等準(zhǔn)確顯示等被發(fā)現(xiàn)。鑒于此，國(guó)際臨床進(jìn)行了大量的完善研究，國(guó)際肺癌研究學(xué)會(huì)（International Association for the Study of Lung Cancer，IASLC）、歐洲呼吸學(xué)會(huì)（European Respiratory Society，ERS）及美國(guó)胸科學(xué)會(huì)（American Thoracic Society，ATS）等共同公布肺腺癌的國(guó)際多學(xué)科分析，嚴(yán)格定義AAH、AIS、MIA及IA[5]，但是即便如此，在臨床診斷中不同分型、分期肺腺癌仍然存在較多問(wèn)題，如AIS多有纖維化增寬肺泡間隔塌陷，形成包埋性腺泡，與MIA浸潤(rùn)性腺泡區(qū)別難度較大，而AIS中乳頭狀機(jī)構(gòu)與乳頭狀浸潤(rùn)癌的區(qū)分難度較大[6]，因此病理醫(yī)生面臨較大的挑戰(zhàn)。

β-Tubulin-Ⅲ作為微管蛋白家族主要成員，研究發(fā)現(xiàn)其不僅能夠在高級(jí)別非神經(jīng)系統(tǒng)來(lái)源的惡性腫瘤中呈強(qiáng)陽(yáng)性，同時(shí)異常表達(dá)、分布等可提示腫瘤發(fā)生、細(xì)胞增殖失控、無(wú)限生長(zhǎng)、侵襲等惡性生物學(xué)行為[7]。β-Tubulin-Ⅲ強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)于早期肺腺癌有預(yù)測(cè)作用，低表達(dá)患者可從鉑類+紫杉類藥物化療中獲益，而高表達(dá)患者能夠從順鉑+長(zhǎng)春瑞濱的輔助化療中獲益，一般認(rèn)為低表達(dá)患者的無(wú)病生存期、總生存率更優(yōu)。本研究中，低分化36例，高分化24例，與患者術(shù)前TNM分期基本吻合，證實(shí)以β-Tubulin-Ⅲ強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域輔助診斷腫瘤分化情況與腫瘤分期有一定的關(guān)聯(lián)性。研究結(jié)果顯示，AAH、AIS及MIA腫瘤細(xì)胞均基本無(wú)β-Tubulin-Ⅲ表達(dá)，IA中β-Tubulin-Ⅲ表達(dá)較高、呈現(xiàn)高表達(dá)，MIA中腫瘤細(xì)胞絕大部分β-Tubulin-Ⅲ為陰性表達(dá)，極少數(shù)活躍增生的腫瘤細(xì)胞為散在陽(yáng)性表達(dá)。楊清海等[8]在研究中發(fā)現(xiàn)MIA中包埋性腺泡呈β-Tubulin-Ⅲ表達(dá)陰性，而乳頭樣生長(zhǎng)、實(shí)性生長(zhǎng)、微乳頭樣生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞、浸潤(rùn)性腺泡β-Tubulin-Ⅲ呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，IA腫瘤細(xì)胞呈β-Tubulin-Ⅲ陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性分均顯著高于其他分型。由此可見，腫瘤所具備的侵襲性行為、生長(zhǎng)方式等，與β-Tubulin-Ⅲ表達(dá)有關(guān)。許多研究指出，在肺腺癌診斷中檢出微乳頭成分提示預(yù)后不良，而這與病理分期、是否轉(zhuǎn)移均有關(guān)系。趙曉麗等[9]研究發(fā)現(xiàn)β-Tubulin-Ⅲ陽(yáng)性表達(dá)能夠突出顯示肺泡腔內(nèi)脫落的微乳頭狀結(jié)構(gòu)腺癌。本研究中，T3～4期、N2～3期患者的β-Tubulin-Ⅲ陽(yáng)性表達(dá)高于 T1～2期、N0～1期，證實(shí)β-Tubulin-Ⅲ在肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移時(shí)均有參與，從而為臨床早期診斷、治療方式的選擇提供準(zhǔn)確的依據(jù)，患者術(shù)后隨訪結(jié)果證實(shí)，β-Tubulin-Ⅲ陽(yáng)性及高表達(dá)患者預(yù)后更差，術(shù)后轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)率更高。

綜上所述，β-Tubulin-Ⅲ在肺腺癌術(shù)前分期診斷中應(yīng)用，可在不同分型、TNM分期腫瘤中呈現(xiàn)出不同表達(dá)，為臨床診斷提供準(zhǔn)確的參考。