許 欣，潘 媛，謝曉芳，唐光梅，彭 成

（成都中醫(yī)藥大學藥學院 西南特色中藥資源重點實驗室，四川 成都 611137）

氫溴酸樟柳堿（Anisodine Hydrobromide，AH）是從茄科（Solanaceae）植物唐古特山莨菪Anisodus tanguticaMaxim［Anisodus tanguticus（Maxim）Pascher 中提取得到的一種中樞性抗膽堿藥［1］。其藥理活性廣泛，具有散大瞳孔、對抗乙酰膽堿降壓、松弛平滑肌痙攣、緩解有機磷中毒與預防組織胺性哮喘的效果，通過離體兔耳灌流實驗發(fā)現對血管呈現低劑量（5 μg/kg）時有擴張血管的作用，和高劑量時（2 000 μg/kg）收縮血管作用［2］。已開發(fā)的成藥如氫溴酸樟柳堿注射液可用于治療偏頭痛型血管性頭痛［3］、視網膜血管痙攣［4］、青光眼［5］和缺血性腦卒中［6］等疾病?？梢?，氫溴酸樟柳堿對血管性疾病具有一定的預防和治療作用，這與其具有血管活性有關。此外，以往的報道證明氫溴酸樟柳堿具有改善微循環(huán)障礙作用［7］?，F代研究發(fā)現，中醫(yī)血瘀證的病理生理基礎與血管痙攣、血液流變學改變和微循環(huán)障礙等有關［8］。然而氫溴酸樟柳堿對血液或血管的作用缺乏較系統的研究。

研究團隊前期研究表明氫溴酸樟柳堿對缺血性腦卒中大鼠有保護作用，有效劑量為0.3～2.4 mg/kg［9-13］。本實驗從局部微循環(huán)和整體血流變以及血小板上研究氫溴酸樟柳堿對血瘀證的影響。選擇經典的鹽酸腎上腺素復加冰水浴的方法復制血瘀癥模型、腎上腺素致小鼠耳廓微循環(huán)障礙模型和Dextran T-500 致小鼠腦膜微循環(huán)障礙模型，及體外ADP 誘導的血小板聚集法，研究氫溴酸樟柳堿對血液系統中在血液流變學、微循環(huán)和血小板聚集的影響，為臨床應用提供依據。

1 材料

1.1 動物 KM 小鼠，SPF 級，雌雄各半，體質量（20±2）g，購自成都達碩實驗動物有限公司，生產許可證號SYXK（川）2015-30；SD 大鼠，SPF 級別，雌雄各半，體質量（200±20）g，成都達碩實驗動物有限公司，生產許可證號SCXK（川）2015-30；實驗兔，雌雄各半，體質量（2～2.5）kg，成都達碩實驗動物有限公司，生產許可證號SCXK（川）2018-17。

1.2 藥物與試劑 氫溴酸樟柳堿（高效液相色譜，純度＞98.5%，批號140903）購自成都第一藥業(yè)有限公司，臨用前用蒸餾水配制成實驗所需濃度；尼莫地平注射液（規(guī)格10 mL∶10 mg，拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司，批號BXHP921），臨用前用生理鹽水配成0.05 mg/mL 備用；阿司匹林［西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司，批號MKBQ8 444 V］；阿魏酸鈉（源葉生物科技有限公司，批號H26M6L1）；腺苷-5′-二磷酸鈉鹽［西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司，批號SLBL1 267 V］；鹽酸腎上腺素注射液［規(guī)格1 mL∶1 mg，遠大醫(yī)藥（中國）有限公司提供，批號170902］，臨用前配成0.1 mg/mL 備用；Dextran T-500（規(guī)格為10 g，北京索萊寶科技有限公司，批號826C052），臨用前用蒸餾水配成10%溶液備用。

1.3 儀器 PeriFlux 6000（瑞典Perimed AB 公司）；BL-420 醫(yī)學圖像分析系統（成都泰盟科技公司）；UB203 型正置生物顯微鏡（重慶澳浦光電技術有限公司）；SA-6000 自動血流變測試儀（廈門海菲生物技術有限公司）；血小板聚集儀（北京賽科希德科技發(fā)展有限公司）。

2 方法

2.1 大鼠血瘀證實驗 取SD 大鼠56 只，雌雄各半，待適應環(huán)境后，按體質量隨機分為正常組、模型組、阿司匹林組（16 mg/kg）及氫溴酸樟柳堿高、中、低、極低劑量（2.4、1.2、0.6、0.3 mg/kg），每組8 只。連續(xù)尾靜脈給藥7 d，在第8 天，除空白組外，其余各組均頸背部皮下注射1 mg/kg 鹽酸腎上腺素溶液，2 h 后大鼠在冰水（4 ℃）游泳5 min；2 h 后，再次皮下注射鹽酸腎上腺素溶液（1 mg/kg）。禁食20 h 后，腹主動脈取血，采用SA-6000自動血流變測試儀器檢測全血黏度切變率1、全血切變率5、全血切變率30、全血切變率200、血漿黏度、壓積、全血高切相對指數、全血低切相對指數、紅細胞聚集指數、全血低切還原黏度、全血高切還原黏度、紅細胞剛性指數、紅細胞變形指數TK 和血漿纖維蛋白原等血液流變學指標。

2.2 小鼠微循環(huán)障礙實驗

2.2.1 小鼠軟腦膜微循環(huán)實驗 取KM 小鼠70 只，雌雄各半，待適應環(huán)境后，按質量隨機分為正常組、模型組、尼莫地平組（0.5 mg/kg）及氫溴酸樟柳堿高、中、低、極低劑量組（2.4、1.2、0.6、0.3 mg/kg），每組10 只。小鼠用10%水合氯醛腹腔注射進行麻醉后，剪開頭部頂骨處的皮膚，將多普勒血流儀的激光光纖探頭置于兩側顳骨正中位置，用膠水固定。觀察多普勒顯示器所顯示的血流灌溉量和灌溉曲線的變化，待血流灌溉曲線穩(wěn)定，然后，各組小鼠尾靜脈注射相應藥物預防給藥，給藥15 min 后測得給藥后的血流灌溉量（a1）。再除正常組外，其余各組尾靜脈注射10% Dextran T-500 溶液，正常組給予等體積生理鹽水，記錄造模后15 min 時的血流灌溉量（a2），計算并比較不同組的血流灌溉量變化率（A）。

A＝［（a1-a2）/a1］×100%。

非洲豬瘟病毒和經典豬瘟病毒若要通過飼料傳播，飼料需被病毒污染且以傳染性形式存活。不幸的是，在跨境運輸中，僅少數飼料原料做了病毒存活性評估，來自美國多個委員會的一份關于飼料原料安全性的聯合文件給出了用于評估原料傳播風險的決策樹。

2.2.2 小鼠耳廓微循環(huán)實驗 按照“2.2.1”項下分組。采用10%水合氯醛腹腔注射小鼠進行麻醉，將麻醉后的小鼠耳廓平整的鋪在載玻片上，滴加一兩滴液體石蠟固定，在透射光下用100 倍鏡下，用BL-420 醫(yī)學圖像分析系統觀察小鼠正常狀態(tài)下的耳廓微循環(huán)，用全自動圖像分析儀上的顯微鏡微尺測量記錄血管輸入直徑、血管輸出直徑，并觀察記錄血管數目和血管交叉網數目。待圖像穩(wěn)定后，在耳廓表面滴加0.1 mL 鹽酸腎上腺素溶液進行造模，15 min后，用吸水紙吸去剩余的鹽酸腎上腺素溶液，同前法測量并記錄各指標的值；隨后各組立即尾靜脈注射相應藥物，模型組和正常組注射等劑量的生理鹽水，陽性對照組注射等劑量的尼莫地平溶液，觀察并記錄給藥后15、30、45、60 min 時耳廓微循環(huán)各指標的值。

2.3 ADP 誘導的兔體外血小板聚集實驗

2.3.1 富血小板血漿（PRP）貧血小板血漿（PPP）的制備 正常家兔心臟取血20 mL，3.8%枸櫞酸鈉（1∶9）抗凝，上下輕輕顛倒搖晃，使抗凝劑與血液均勻混合，血液第1 次以800 r/min 離心10 min，分離上層血漿；再以相同的轉速和時間進行第2 次離心，取出上層血漿，即得PRP。取第1 次離心的下層血液，以3 500 r/min 離心10 min，取上層血漿即得PPP。

2.3.2 最大聚集率的測定和抑制率的計算 取上述兩種血漿，用PPP 調零，以PRP 為血小板供體。受試藥物每個濃度設六個平行樣本。取7 個比濁管，加入280 μL PPP，正常組PPP 中加入10 μL 生理鹽水，阿魏酸鈉Ⅰ組PPP 中加入10 μL 100 mmol/L 阿魏酸鈉溶液，阿魏酸鈉Ⅱ組PPP 中加入10 μL50 mmol/L 阿魏酸鈉溶液，阿魏酸鈉Ⅲ組PPP 中加入10 μL 25 mmol/L 阿魏酸鈉溶液；氫溴酸樟柳堿Ⅰ組PPP 中加入10 μL 100 mmol/L 氫溴酸樟柳堿溶液，氫溴酸樟柳堿Ⅱ組PPP 中加入10 μL 50 mmol/L 氫溴酸樟柳堿溶液，氫溴酸樟柳堿Ⅲ組PPP 中加入10 μL 25 mmol/L 氫溴酸樟柳堿溶液。另取7 個比濁管，加入280 μL PRP，在PRP 中加入10 uL 上述各組溶液，作為待測溶液。將血小板聚集儀預熱至37 ℃后，先在各自的空白溶液中加入10 μL 生理鹽水，放入測試孔中調零。然后換成相對應的待測溶液，預熱60 s，加入10 μL 腺苷-5′-二磷酸鈉鹽溶液，按比濁法（光學法）用血小板聚集儀測定血小板最大聚集率。按公式計算提取物或陽性藥血小板聚集的抑制率。重復上述操作六次。聚集抑制率＝（對照組血小板最大聚集率-給藥組血小板最大聚集率）/對照組血小板最大聚集率。

2.4 統計學分析 采用SPSS 22.0 軟件進行數據資料的統計分析，正態(tài)計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 氫溴酸樟柳堿對血瘀證大鼠血液流變學的影響 從表1～4 可知。與正常組相比較，模型組除血漿黏度外的其他血液流變學參數均升高（P＜0.01）。與模型組相比，阿司匹林組和氫溴酸樟柳堿各組可降低全血黏度切變率、全血還原黏度（低切、高切）、全血相對指數（高切、低切）及紅細胞聚集指數、紅細胞剛性指數、紅細胞變形指數（P＜0.05，P＜0.01）。

表1 氫溴酸樟柳堿對急性血瘀證大鼠全血黏度的影響（，mPa·s，n=8）

表1 氫溴酸樟柳堿對急性血瘀證大鼠全血黏度的影響（，mPa·s，n=8）

注：與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

表2 氫溴酸樟柳堿對急性血瘀證大鼠血漿黏度、還原黏度的影響（，mPa·s，n=8）

表2 氫溴酸樟柳堿對急性血瘀證大鼠血漿黏度、還原黏度的影響（，mPa·s，n=8）

注：與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

表3 氫溴酸樟柳堿對急性血瘀證大鼠壓積、全血相對指數及紅細胞聚集指數的影響（，n=8）

表3 氫溴酸樟柳堿對急性血瘀證大鼠壓積、全血相對指數及紅細胞聚集指數的影響（，n=8）

注：與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

表4 氫溴酸樟柳堿對紅細胞剛形指數、紅細胞變形指數TK 及血漿纖維蛋白原的影響（，n=8）

表4 氫溴酸樟柳堿對紅細胞剛形指數、紅細胞變形指數TK 及血漿纖維蛋白原的影響（，n=8）

注：與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

3.2 氫溴酸樟柳堿對腦膜微循環(huán)障礙的影響 在軟腦膜微循環(huán)實驗中，正常小鼠造模前后，血流灌溉曲線平穩(wěn)，波動較小，而模型組小鼠在尾靜脈注射10% DextranT-500 溶液后，血流灌溉曲線迅速下降，溉灌量變化率升高（P＜0.05）。與模型組比較，氫溴酸樟柳堿各劑量和尼莫地平均能減少血液灌溉量的變化率，其中以氫溴酸樟柳堿高劑量組和尼莫地平組最明顯（P＜0.05）。各組小鼠的腦部微血管的血流灌溉量的變化結果見圖1、表5。

3.3 氫溴酸樟柳堿對耳廓微循環(huán)障礙的影響 正常小鼠耳廓微血管輪廓清晰、供血豐富、呈樹狀分布，毛細血管較多，且紅細胞呈線性流動，無血流淤滯現象。模型組耳廓微血管輪廓模糊不清，血管直徑減小，毛細血管減少，紅細胞呈粒性流動，偶見血流淤滯現象。氫溴酸樟柳堿各劑量組和尼莫地平組均能改善小鼠的耳廓微循環(huán)障礙（圖2～3）。

圖1 氫溴酸樟柳堿對腦膜微循環(huán)障礙小鼠腦膜血流灌溉曲線的影響

圖2 氫溴酸樟柳堿對小鼠耳廓微循環(huán)障礙的影響（輸入/輸出血管直徑，60 min）

3.3.1 氫溴酸樟柳堿對耳廓微循環(huán)障礙小鼠血管輸入直徑的影響 模型組小鼠耳廓血管輸入直徑減小，且持續(xù)至60 min仍低于正常組（P＜0.01）。與模型組比較，尼莫地平組給藥15 min 后，血管輸入直徑開始恢復，給藥45 min時，血管輸入直徑增加（P＜0.01）；氫溴酸樟柳堿高劑量組給藥后15 min 血管輸入直徑開始恢復，（P＜0.05，P＜0.01）。氫溴酸樟柳堿中劑量組給藥后15 min 血管輸入直徑也開始恢復（P＜0.01）。氫溴酸樟柳堿低劑量組給藥15 min后血管輸入直徑開始恢復，但極低劑量組在各階段并無明顯增加。見表6。

圖3 氫溴酸樟柳堿對小鼠耳廓微循環(huán)障礙的影響（血管數目/血管交叉網，60 min）

表5 氫溴酸樟柳堿對腦膜微循環(huán)障礙小鼠腦膜血流灌溉量的影響（，n=10）

表5 氫溴酸樟柳堿對腦膜微循環(huán)障礙小鼠腦膜血流灌溉量的影響（，n=10）

注：與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05。

3.3.2 氫溴酸樟柳堿對耳廓微循環(huán)障礙小鼠血管輸出直徑的影響 正常組小鼠血管輸出直徑在實驗時間內無明顯變化。與正常組比較，模型組小鼠耳廓血管輸出直徑減小，且持續(xù)至60 min 仍低于正常組。與模型組比較，氫溴酸樟柳堿高、中、低劑量組在給藥60 min 內的各個時間點的血管輸出直徑均與模型組無明顯差異尼莫地平組在給藥后各階段血管輸出直徑顯著升高（P＜0.05）但氫溴酸樟柳堿極低劑量組的血管輸出直徑較模型組進一步減小，且隨著給藥時間的增加變化不大。見表7。

表6 氫溴酸樟柳堿對耳廓微循環(huán)障礙小鼠血管輸入直徑的影響（，μm，n=10）

表6 氫溴酸樟柳堿對耳廓微循環(huán)障礙小鼠血管輸入直徑的影響（，μm，n=10）

注：與正常組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05；**P＜0.01。

3.3.3 氫溴酸樟柳堿對耳廓微循環(huán)障礙小鼠血管數目的影響 正常組小鼠血管數目在實驗時間內無明顯變化。與正常組比較，模型組小鼠造模后其耳廓血管數目明顯減少，并持續(xù)至60 min 后（P＜0.01）。與模型組比較，尼莫地平組和氫溴酸樟柳堿高、中、低劑量組給藥15 min 后，血管數目顯著性增加，且隨著給藥時間延長和劑量的增加開放數目不斷增加，甚至大于正常組，呈明顯量-時-效正相關（P＜0.01）；氫溴酸樟柳堿極低劑量組無明顯作用。結果見下表8。

3.3.4 氫溴酸樟柳堿對耳廓微循環(huán)障礙小鼠血管交叉網的影響 正常組小鼠血管交叉網在實驗時間內無明顯變化。與正常組比較，模型組小鼠在造模后耳廓血管交叉網數目顯著減?。≒＜0.01），且持續(xù)至60 min 仍低于正常組。與模型組比較，尼莫地平組和氫溴酸樟柳堿高、中、低劑量能明顯增加血管交叉網數目，自給藥15 min 時即有顯著作用（P＜0.01），且呈明顯量-時-效正相關，作用與對血管數目的影響一致；氫溴酸樟柳堿極低劑量無明顯作用。見表9。

表7 氫溴酸樟柳堿對耳廓微循環(huán)障礙小鼠血管輸出直徑的影響（，μm，n=10）

表7 氫溴酸樟柳堿對耳廓微循環(huán)障礙小鼠血管輸出直徑的影響（，μm，n=10）

注：與正常組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05。

表8 氫溴酸樟柳堿對耳廓微循環(huán)障礙小鼠血管數目的影響（，個，n=10）

表8 氫溴酸樟柳堿對耳廓微循環(huán)障礙小鼠血管數目的影響（，個，n=10）

注：與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

表9 氫溴酸樟柳堿對耳廓微循環(huán)障礙小鼠血管交叉網的影響（，個，n=10）

表9 氫溴酸樟柳堿對耳廓微循環(huán)障礙小鼠血管交叉網的影響（，個，n=10）

注：與正常組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，**P＜0.01。

3.4 氫溴酸樟柳堿對ADP 誘導體外血小板最大聚集率的影響 從表10 可知，與正常組比較，陽性藥阿魏酸鈉呈劑量依賴性抑制ADP 誘導的家兔血小板聚集，差異具有顯著性（P＜0.01）；給藥組氫溴酸樟柳堿Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組能明顯的抑制ADP 誘導的家兔血小板聚集（P＜0.01），沒有明顯的劑量依賴性。

表10 氫溴酸樟柳堿對ADP 誘導下的血小板聚集的影響（，n=6）

表10 氫溴酸樟柳堿對ADP 誘導下的血小板聚集的影響（，n=6）

注：與正常組比較，**P＜0.01。

4 討論

血瘀會造成血流灌溉量的減少，營養(yǎng)物質和氧氣不能滿足組織細胞氧化代謝的需要，CO2等新陳代謝廢物不能及時排除，氧氣不能及時的更替，引起組織細胞損傷，導致相應器官的功能紊亂，嚴重者造成器官功能衰退［14］。血瘀發(fā)生期間，去甲腎上腺素、腎上腺素和兒茶酚胺分泌量會顯著升高，通過與α2腎上腺素受體結合，血小板被激活，聯合其他的刺激因素會導致紅細胞聚集指數增強、全血黏度增加［15］。

高分子右旋糖苷［16］或鹽酸腎上腺素［17］復制血瘀證模型為經典的復制血瘀證的方法，動物靜脈注射高分子右旋糖苷會造成動脈和靜脈血流速度減慢，血流灌溉量降低，部分微血管內可以觀察到紅細胞聚集［18］。氫溴酸樟柳堿的適應癥中如偏頭痛、缺血性腦卒中等，在中醫(yī)臨床上常有血瘀的病理表現，故本文采用經典的鹽酸腎上腺素溶液復加冰水浴誘導的大鼠急性血瘀證大鼠模型；另外，氫溴酸樟柳堿主治的病癥多與腦部血管和微循環(huán)有關，故本文在采用經典的鹽酸腎上腺素致小鼠耳廓微循環(huán)障礙模型的基礎上，還選用了尾靜脈注射高分子右旋糖酐法復制小鼠腦膜微循環(huán)障礙模型，從預防和治療兩方面探究氫溴酸樟柳堿對微循環(huán)障礙的作用，使其更加符合本藥的臨床應用特點。ADP 誘導的兔體外血小板聚集實驗也是也是經典而穩(wěn)定的方法，適用于本文的研究目的。通過上述模型和方法，從血液流變學、微循環(huán)和血小板三個方面探討氫溴酸樟柳堿對血流的影響。

血液流變學是研究循環(huán)血液流動性、變形性、凝固性、黏彈性以及心血管黏滯性的的科學，現代研究表明，但人體患心血管疾病時，血液的流變性發(fā)生異常，從而引起全身或局部循環(huán)或微循環(huán)障礙［19］。而血液的黏、濃、凝、聚是臨床上造成心血管疾病的重要原因。全血黏度主要取決于紅細胞數量的多少和性能，血漿的黏度主要取決于血漿蛋白的含量［20］。全血黏度的增高會引起紅細胞變形性降低和聚集性增高，使黏度進一步增高、使血流進一步變慢，這樣有利于血小板的粘附和聚集，最終導致心血管疾?。?1］。本研究也進一步驗證了血瘀證會使大鼠全血的的高切黏度、中切黏度、低切黏度、壓積、全血高切還原黏度、全血低切還原黏度、全血高切相對黏度、全血低切相對黏度、紅細胞變形指數、紅細胞聚集指數、紅細胞剛性指數均顯著性的升高；軟腦膜微循環(huán)障礙和耳廓微循環(huán)障礙會導致小鼠軟腦膜血流灌溉量顯著性的減少、血流速度變慢、血管變窄、血管數目變少、血管交叉變少和血細胞變形，導致血液瘀滯。

本實驗研究發(fā)現，氫溴酸樟柳堿能改善急性血瘀證模型大鼠的大部分血流變指標，以及改善微循環(huán)障礙小鼠的病理狀態(tài)。氫溴酸樟柳堿能減低血瘀證模型大鼠的全血黏度、壓積、全血還原黏度、全血相對黏度、紅細胞變形指數、紅細胞聚集指數、紅細胞剛性指數的值，而對血漿纖維蛋白原、血漿黏度的值無明顯作用。氫溴酸樟柳堿能改善減低微循環(huán)障礙造成的血流灌溉量的減低，以及通過舒張血管、增加微血管數目、增加血管交叉點的數目改善小鼠的耳廓微循環(huán)障礙。體外實驗證明，氫溴酸樟柳堿能抑制ADP 誘導的血小板聚集，降低血小板最大聚集率。

綜上所述，氫溴酸樟柳堿能改善急性血瘀證和微循環(huán)障礙模型的血液血流和血管狀態(tài)，及抗血小板聚集，結合本藥的適應癥，提示氫溴酸樟柳堿治療缺血性腦卒中、視網膜病變、偏頭痛等疾病的機制之一可能與血液系統和血管活動有關。