潘媛， 彭成， 江虹雨， 岳美穎， 唐光梅， 謝曉芳

(成都中醫(yī)藥大學藥學院，成都610075)

樟柳堿是從唐古特東莨菪堿植物中提取的一種抗膽堿能藥，藥理作用廣泛，以對神經(jīng)系統(tǒng)的作用為主(彭建中，金麗容，1982)，其次有抗心肌缺血(陳錦明等，1983)、抗肺急性損傷(王火等，1999)、抗腎損傷(吳廣禮等，2002)、抗胃潰瘍(張建福等，1990)、抗組胺受體(詹皓等，1987)等作用。在臨床上，氫溴酸樟柳堿可用于偏頭痛、血管性頭痛等，且早在1975年就有用于偏頭痛的臨床報道(四川醫(yī)學院附院神經(jīng)科，徐州醫(yī)學院附院神經(jīng)科，1975)。依據(jù)偏頭痛的血管源學說，認為顱內(nèi)動脈收縮引起先兆，然后顱外血管擴張，血管周圍組織產(chǎn)生血管活性物質(zhì)導致無菌性炎癥而誘發(fā)頭痛。但氫溴酸樟柳堿對血管的作用尚不清楚。本實驗研究氫溴酸樟柳堿對離體血管環(huán)的作用，擬初步明確氫溴酸樟柳堿對血管收縮舒張功能的影響。

1 實驗材料

1.1 藥品與試劑

氫溴酸樟柳堿(高效液相色譜純度>98.5%)原料藥由成都第一制藥提供，生產(chǎn)批號：14120，臨用前精密稱取氫溴酸樟柳堿0.301 8 g用超純水溶解至1.5 mL，配置成0.5 mol·L-1的氫溴酸樟柳堿母液；苯腎上腺素(phenylephrine，PHE；Sigma)，生產(chǎn)批號：1000957684；左旋硝基精氨酸甲酯(Nω-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME；Sigma)，生產(chǎn)批號：10093568；乙酰膽堿(acetylcholine，Ach；Bomei)，生產(chǎn)批號：A0041；格列本脲(glyburide，Gly；Sigma)，生產(chǎn)批號：1001896356；4-氨基吡啶(4-Aminopyridine，4-AP；Sigma)，生產(chǎn)批號：1001809775；四乙基氯化銨(tetraethylammonium chloride，TEA；Sigma)，生產(chǎn)批號：1000940891。

1.2 實驗動物

SPF級成年健康雌性或雄性SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購自四川省醫(yī)學科學院實驗動物研究所，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2013-15，實驗動物使用許可證號：SYXK(川)2008-049。飼養(yǎng)溫度21～27 ℃，濕度50%±5%，晝夜光照及通風環(huán)境自然調(diào)節(jié)。實驗程序嚴格按照動物管理章程。

1.3 實驗儀器

HH-4型數(shù)顯電子恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)，F(xiàn)A2004B型電子天平(上海越平科學儀器有限公司)，D2-8實驗室純水系統(tǒng)(成都寶塞思科技有限公司)，可調(diào)式移液器(Thermo Fisher Scientific)，低溫冰箱(青島海爾股份有限公司)，M870B5/10型離體組織灌流系統(tǒng)、ML870型PowerLab生物信號采集系統(tǒng)、MLT0201型張力換能器、LabchartPro均購自埃德儀器國際貿(mào)易(上海)有限公司。

2 實驗方法

2.1 大鼠頸總動脈環(huán)的制備

用10%水合氯醛麻醉大鼠，然后快速取出其頸總動脈，并置于O2飽和且持續(xù)通入95%O2+5%CO2的4 ℃的K-H液(NaCl：118.4 mmol·L-1，KCl：4.7 mmol·L-1，CaCl2：2.5 mmol·L-1，KH2PO4：1.2 mmol·L-1，MgSO4：1.2 mmol·L-1，Na2HCO3：25.0 mmol·L-1，C6H12O6：10.1 mmol·L-1，乙二胺四乙酸：0.03 mmol·L-1；pH7.4)，剔除周圍的結締組織，剪成大約3 mm的血管環(huán)，并用2根針灸針制成的掛鉤水平懸掛于浴管內(nèi)，一端固定于浴管內(nèi)，另一端連接張力換能器，并將前負荷調(diào)節(jié)為0.8 g，使用PowerLab生物信號采集系統(tǒng)采集和記錄張力的變化。浴槽內(nèi)含有K-H液，恒溫37 ℃，持續(xù)不斷通入95%O2+5%CO2，每15 min換一次預熱到37 ℃的K-H液，共平衡60 min。此后，用90 mmol·L-1KCl連續(xù)刺激大鼠頸總動脈環(huán)連續(xù)2次，每次40 min，以誘發(fā)最大張力。刺激后，用預熱到37 ℃的K-H液連續(xù)沖洗3次，每次5 min，待恢復到基礎狀態(tài)后，調(diào)節(jié)前負荷至0.8 g，再穩(wěn)定30～60 min。當連續(xù)相同刺激所引起的頸總動脈環(huán)血管收縮幅度差小于10%時，認為血管穩(wěn)定，可以開始實驗(胡冠英，2015)。

2.2 血管環(huán)去內(nèi)皮檢測

將削好的牙簽穿過制備好的血管環(huán)內(nèi)腔，輕輕旋轉(zhuǎn)，以機械力去除其內(nèi)皮。再用1 μmol·L-1PHE收縮血管環(huán)，待收縮張力達到坪值(即張力不再上升)后，往槽內(nèi)加入10 μmol·L-1Ach舒張血管環(huán)，若舒張幅度大于80%，則認為內(nèi)皮完整；若舒張幅度小于10%，則認為去內(nèi)皮成功。

2.3 氫溴酸樟柳堿對KCl預收縮血管環(huán)的影響

將符合實驗條件的血管環(huán)隨機分為KCl預收縮對照組(n=8)、KCl預收縮加氫溴酸樟柳堿組(n=8)。血管環(huán)穩(wěn)定后，往浴槽內(nèi)加入90 mmol·L-1KCl預收縮，當血管環(huán)收縮張力達到坪值時(約40 min)，向浴槽內(nèi)累積加入氫溴酸樟柳堿(1×10-4～5×10-3mol·L-1)或?qū)φ談?K-H液)，建立氫溴酸樟柳堿濃度依賴舒張效應曲線，觀察和比較不同濃度氫溴酸樟柳堿對90 mmol·L-1KCl預收縮血管環(huán)的舒張作用。以90 mmol·L-1KCl所致的血管環(huán)最大收縮張力為100%，計算各濃度下氫溴酸樟柳堿所致的舒張百分比。

2.4 氫溴酸樟柳堿對PHE預收縮血管環(huán)的影響

將符合實驗條件的血管環(huán)隨機分為PHE預收縮對照組(n=8)、PHE預收縮加氫溴酸樟柳堿組(n=8)。血管環(huán)穩(wěn)定后，往浴槽內(nèi)加入1 μmol·L-1PHE預收縮，當血管環(huán)的收縮張力達到坪值時(約20 min)，向浴槽內(nèi)累積加入氫溴酸樟柳堿(1×10-4～5×10-3mol·L-1)或?qū)φ談?K-H液)，建立氫溴酸樟柳堿濃度依賴舒張效應曲線，觀察和比較不同濃度氫溴酸樟柳堿對1 μmol·L-1PHE預收縮血管環(huán)的舒張作用。以1 μmol·L-1PHE所致的血管環(huán)最大收縮張力為100%，計算各濃度下氫溴酸樟柳堿所致的舒張百分比。

2.5 氫溴酸樟柳堿對PHE預收縮內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮的血管環(huán)的影響

將符合實驗條件的血管環(huán)隨機分為PHE預收縮加氫溴酸樟柳堿組(n=8)、去內(nèi)皮組(n=8)。取去內(nèi)皮的血管環(huán)，待血管環(huán)穩(wěn)定后，向浴槽內(nèi)加入1 μmol·L-1PHE預收縮，當血管環(huán)收縮張力達到坪值時(約20 min)，向浴槽內(nèi)累積加入氫溴酸樟柳堿(1×10-4～5×10-3mol·L-1)，建立氫溴酸樟柳堿的濃度依賴舒張效應曲線，觀察和比較不同濃度下氫溴酸樟柳堿對1 μmol·L-1PHE預收縮內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮的血管環(huán)的舒張作用。分別以1 μmol·L-1PHE對內(nèi)皮完整或去內(nèi)皮的血管環(huán)所致的最大收縮張力為100%，分別計算各濃度氫溴酸樟柳堿所致的舒張百分比。

2.6 氫溴酸樟柳堿對L-NAME預孵血管環(huán)的影響

將符合實驗條件的血管環(huán)隨機分為PHE預收縮加氫溴酸樟柳堿組(n=8)、L-NAME預孵組(n=8)。血管環(huán)穩(wěn)定后，向浴槽內(nèi)加入1 μmol·L-1PHE預收縮，當血管環(huán)收縮張力達到坪值時(約20 min)，再加入1×10-4mol·L-1L-NAME預孵20 min，向浴槽內(nèi)累積加入氫溴酸樟柳堿(1×10-4～5×10-3mol·L-1)，建立氫溴酸樟柳堿濃度依賴舒張效應曲線，在1 μmol·L-1PHE預收縮的基礎上，觀察和比較各濃度氫溴酸樟柳堿對L-NAME預孵血管環(huán)的舒張作用。以1 μmol·L-1PHE對血管環(huán)所致的最大收縮張力為100%，計算各濃度氫溴酸樟柳堿對L-NAME預孵血管環(huán)所致的舒張百分比。

2.7 氫溴酸樟柳堿對鉀離子通道阻滯劑預孵血管環(huán)的影響

將符合實驗條件的血管環(huán)隨機分為PHE預收縮加氫溴酸樟柳堿組(n=8)、TEA預孵組(n=8)、4-AP預孵組(n=8)、Gly預孵組(n=8)、BaCl2預孵組(n=8)。血管環(huán)穩(wěn)定后，向浴槽內(nèi)加入1 μmol·L-1PHE預收縮，當血管環(huán)收縮張力達到坪值時(約20 min)，再分別加入鉀離子通道阻滯劑(1×10-2mol·L-1TEA、1×10-3mol·L-14-AP、1×10-5mol·L-1Gly或1×10-4mol·L-1BaCl2)預孵20 min，向浴槽內(nèi)累積加入氫溴酸樟柳堿(1×10-4～5×10-3mol·L-1)，建立氫溴酸樟柳堿的濃度依賴舒張效應曲線，在1 μmol·L-1PHE預收縮血管環(huán)的基礎上，觀察和比較各濃度氫溴酸樟柳堿對各種鉀離子通道阻滯劑預孵血管環(huán)的舒張作用。以1 μmol·L-1PHE對血管環(huán)所致的最大收縮張力為100%，計算各濃度氫溴酸樟柳堿對鉀離子通道阻滯劑預孵血管環(huán)所致的舒張百分比。

2.8 氫溴酸樟柳堿對血管環(huán)外Ca2+內(nèi)流和內(nèi)Ca2+釋放的影響

血管環(huán)穩(wěn)定后，觀察氫溴酸樟柳堿對其外Ca2+內(nèi)流和內(nèi)Ca2+釋放的影響。為保證平滑肌細胞內(nèi)Ca2+充足，用100 mmol·L-1KCl收縮血管環(huán)。待張力到達坪值后，用無Ca2+溶液連續(xù)沖洗3次，每次5 min，并用無Ca2+溶液平衡30 min后，浴槽內(nèi)加入氫溴酸樟柳堿2×10-3mol·L-1預孵血管環(huán)20 min，再加入1 μmol·L-1PHE，血管環(huán)呈現(xiàn)短暫收縮。收縮張力達到坪值后，繼續(xù)加入3 mmol·L-1CaCl2，血管環(huán)再次出現(xiàn)收縮并達到峰值，分別觀察在無鈣溶液中氫溴酸樟柳堿預孵對PHE或CaCl2所致血管環(huán)收縮的抑制作用。

2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

3 結果

3.1 氫溴酸樟柳堿對KCl預收縮血管環(huán)的影響

氫溴酸樟柳堿可濃度依賴地(1×10-4～5×10-3mol·L-1)舒張KCl預收縮血管環(huán)，結果顯示，Emax=33.97%±11.53%，并在低濃度(1×10-4～1×10-3mol·L-1)下有收縮血管的作用(P<0.01，P<0.05)(圖1)。

3.2 氫溴酸樟柳堿對PHE預收縮血管環(huán)的影響

氫溴酸樟柳堿可濃度依賴地(1×10-4～5×10-3mol·L-1)舒張PHE預收縮血管環(huán)，結果顯示，與對照組之間的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，EC50=5.61(3.88， 8.10) mmol·L-1，Emax=47.93%±18.63%(圖2)。

圖1 氫溴酸樟柳堿對KCl預收縮血管環(huán)張力的影響Fig. 1 Effect of anisodine hydrobromide on the tension of KCl precontracted vascular ring (n=8，

*P<0.05，**P<0.01； 下同， the same below

圖2 氫溴酸樟柳堿對苯腎上腺素預收縮血管環(huán)張力的影響Fig. 2 Effect of anisodine hydrobromide on the tension of phenylephrine precontracted vascular ring (n=8，

3.3 氫溴酸樟柳堿對PHE預收縮內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管環(huán)的影響

氫溴酸樟柳堿可濃度依賴性地(1×10-4～5×10-3mmol·L-1)舒張PHE預收縮內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮的血管環(huán)，結果顯示，內(nèi)皮完整血管環(huán)的EC50=5.61(3.88，8.10) mmol·L-1，Emax=47.93%±18.63%；去內(nèi)皮血管環(huán)的EC50=5.64(4.42， 7.20) mmol·L-1，Emax=46.72%±8.97%，與內(nèi)皮完整血管環(huán)的相比，舒張率無明顯變化(P>0.05)(圖3)。

圖3 氫溴酸樟柳堿對苯腎上腺素預收縮的內(nèi)皮完整(E+)和去內(nèi)皮(E-)血管環(huán)張力的影響Fig. 3 Effect of anisodine hydrobromide on the tension of phenylephrine precontracted vascular ring with (E+) and without (E-) endothelium (n=8，

3.4 氫溴酸樟柳堿對L-NAME預孵血管環(huán)的影響

氫溴酸樟柳堿可濃度依賴地(1×10-4～5×10-3mmol·L-1)舒張L-NAME預孵血管環(huán)，結果顯示， Emax=42.44%±16.47%。用L-NAME預孵血管環(huán)后，氫溴酸樟柳堿對血管的舒張效果無明顯減弱(P>0.05)(圖4)。

圖4 氫溴酸樟柳堿對左旋硝基精氨酸甲酯預孵血管環(huán)張力的影響Fig. 4 Effect of anisodine hydrobromide on the tension of Nω-nitro-L-arginine methyl ester precontracted

3.5 氫溴酸樟柳堿對鉀離子通道阻滯劑預孵血管環(huán)的影響

TEA、4-AP、Gly、BaCl2對氫溴酸樟柳堿舒張PHE預收縮血管環(huán)均無明顯作用，Emax分別為91.07%±19.94%(P>0.05)、45.60%±22.88%(P>0.05)、41.11%±8.69%(P>0.05)、41.52%±14.39%(P>0.05)(圖5)。

3.6 氫溴酸樟柳堿對血管環(huán)外Ca2+內(nèi)流和內(nèi)Ca2+釋放的影響

在無Ca2+溶液中，2×10-3mol·L-1氫溴酸樟柳堿可以顯著增強PHE引起的血管短暫收縮，Emax由7.57%±5.99%增加至17.13%±5.58%(P<0.01)，增加了9.56%±9.09%。在此基礎上，加入CaCl2，血管環(huán)再次出現(xiàn)收縮，經(jīng)氫溴酸樟柳堿預孵的血管環(huán)與對照組的收縮率分別為33.13%±6.77%、38.37%±13.24%，二者差異無統(tǒng)計學意義。

4 討論

細胞外流入和細胞內(nèi)Ca2+釋放是血管平滑肌收縮所需Ca2+的主要來源，包括經(jīng)受體操作性鈣通道(receptor operated calcium channel，ROC)和電壓依賴性鈣通道(voltage dependent calcium channel，VDC)的外鈣流入及主要來自肌漿網(wǎng)的內(nèi)鈣釋放(Hamadaetal.，1997；Carmignotoetal.，1998)。KCl誘導的血管收縮是通過細胞膜去極化激活VDC，而PHE則是與α1受體特異性結合激活ROC，外鈣內(nèi)流從而引起血管收縮(Kravtsov & Kwan，1995；Ratz & Berq，2006)。氫溴酸樟柳堿在體外1×10-4～5×10-3mol·L-1范圍內(nèi)能濃度依賴性舒張KCl和PHE誘導的頸總動脈環(huán)收縮，表明氫溴酸樟柳堿舒張血管與抑制ROC和VDC介導的外Ca2+內(nèi)流有關，氫溴酸樟柳堿對PHE預收縮的血管舒張作用強于KCl，且對KCl預收縮血管的作用具有低濃度收縮血管、高濃度舒張血管的雙向作用，這有待進一步探索。

將離體大鼠頸總動脈環(huán)去除內(nèi)皮，或以L-NAME、KCa通道阻滯劑TEA、KV通道阻滯劑4-AP、KIR通道阻滯劑BaCl2和KATP通道抑制劑Gly預孵血管環(huán)，均對氫溴酸樟柳堿的舒張血管作用無顯著抑制作用，表明氫溴酸樟柳堿通過非內(nèi)皮依賴途徑舒張血管，且與NO及Kv、KCa、KIR、KATP通道無關。而在無鈣溶液中的結果提示，氫溴酸樟柳堿促進血管收縮的機制可能與促進肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2+的釋放有關。對于PHE預收縮的去內(nèi)皮血管環(huán)，Emax無明顯變化，表明氫溴酸樟柳堿通過非內(nèi)皮依賴途徑舒張血管。L-NAME不能抑制氫溴酸樟柳堿對PHE誘導的血管環(huán)收縮的舒張作用，表明NO沒有介導氫溴酸樟柳堿對血管環(huán)的舒張作用。鉀離子通道在維持血管張力方面有著重要的作用。本研究在KCl誘導的頸總動脈環(huán)收縮的基礎上，分別用TEA、4-AP、BaCl2和Gly預敷血管環(huán)，發(fā)現(xiàn)均對氫溴酸樟柳堿的血管舒張反應無顯著抑制作用，表明氫溴酸樟柳堿的血管舒張作用與Kv、KCa、KIR、KATP通道無關。氫溴酸樟柳堿對血管環(huán)外Ca2+內(nèi)流和內(nèi)Ca2+釋放的影響結果顯示，其促進血管收縮的機制可能與促進肌漿網(wǎng)內(nèi)Ca2+的釋放有關。

氫溴酸樟柳堿是一種抗膽堿能藥，具有廣泛的藥理活性。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)方面，氫溴酸樟柳堿可改善雙側(cè)頸總動脈結扎所致慢性腦缺血大鼠的氧化應激狀態(tài)，減少神經(jīng)細胞損傷與凋亡，且其機制與減少P53蛋白表達有關(陳丹丹等，2018)；氫溴酸樟柳堿還可對抗線栓法所致的大鼠大腦中動脈阻塞腦缺血/再灌注損傷，降低模型動物病理學評分，提高存活神經(jīng)元數(shù)目，其機制與抗氧化損傷及提高p-Akt的表達有關(陳丹丹等，2017b)；在體外用氯化鈷處理腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞，建立化學性缺氧模型，氫溴酸樟柳堿干預后可顯著提高細胞存活率，較好恢復細胞形態(tài)，其機制與誘導低氧狀態(tài)細胞自噬有關(陳丹丹等，2017a)；氫溴酸樟柳堿還可調(diào)節(jié)正常大鼠腦組織內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)代謝(匡培根等，1984)。除對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用外，氫溴酸樟柳堿也可改善血流變及微循環(huán)。氫溴酸樟柳堿可改善壞死性胰腺炎模型犬的血液流變性(嚴律南等，1990)，改善急性腎功能衰竭大鼠的腎動脈血管功能，保護腎微血管損傷(吳廣禮等，2002)，擴張大鼠腸系膜微動脈管徑(劉萍等，1999)。氫溴酸樟柳堿與普魯卡因的復方制劑——復方樟柳堿被廣泛應用于眼科，可改善眼缺血和保護視神經(jīng)，在臨床上可用于治療視網(wǎng)膜病變、缺血性視神經(jīng)及脈絡膜病變等(彭娟等，2007)。

氫溴酸樟柳堿的藥理作用雖然廣泛，但關于其對血管作用的研究卻鮮有報道。本實驗研究氫溴酸樟柳堿對離體大鼠頸總動脈環(huán)的作用，初步明確氫溴酸樟柳堿能夠濃度依賴性地舒張大鼠頸總動脈環(huán)，且對KCl預收縮的大鼠頸總動脈血管環(huán)具有小劑量收縮、大劑量舒張的雙向作用，與其對血管具有雙向作用的相關實驗報道(陳錦明等，1983)相符。本課題組在后續(xù)還將繼續(xù)就氫溴酸樟柳堿對微循環(huán)的影響做進一步研究。

綜上所述，氫溴酸樟柳堿能夠濃度依賴性地舒張大鼠頸總動脈環(huán)，且其機制與非內(nèi)皮依賴途徑及促肌漿網(wǎng)內(nèi)鈣釋放相關。