姚聲盛，劉小敏，楊曉婷

深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳 518110

急性白血?。╝cute leukemia，AL）是臨床常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤， 主要病理特點(diǎn)為骨髓中異常原始細(xì)胞和幼稚細(xì)胞大量增殖，并抑制骨髓的造血功能[1]。 AL 如不能有效治療，患者的平均生存時(shí)間僅為3 個(gè)月，嚴(yán)重者甚至在確診后數(shù)日內(nèi)死亡[2]。 近年來，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，AL 的治療方案不斷更新， 治療效果也明顯提高，初診AL 的緩解率也較前提高。 但在實(shí)際的臨床工作中，仍有部分患者緩解后還會復(fù)發(fā)。 目前的研究認(rèn)為，完成治療后， 患者體內(nèi)微小殘留病 （minimal-residual disease，MRD）的存在是AL 復(fù)發(fā)的主要因素[3]。檢測AL 患者M(jìn)RD對于判斷預(yù)后，指導(dǎo)治療具有重要意義[4]。 目前，國內(nèi)多主張應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測骨髓樣本的MRD，但骨髓穿刺創(chuàng)傷性大，且取得的標(biāo)本僅能反應(yīng)該部分骨髓的狀況[5]。 該研究對 2016 年 1 月—2018 年 6 月期間收治的136 例AL 患者應(yīng)用FCM 檢測外周血MRD，以探討AL 患者應(yīng)用FCM 進(jìn)行外周血細(xì)胞檢測的臨床意義。 現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇該院血液科收治的AL 患者136 例，所有患者均符合WHO 制定的AL 診斷及分型標(biāo)準(zhǔn)[6]；且初次診斷為AL，并排除急性早幼粒細(xì)胞白血病和其他血液系統(tǒng)疾病，均無白血病史， 無其它惡性腫瘤及心肝腎嚴(yán)重器質(zhì)性疾病， 入組前未接受白血病的相關(guān)治療。 急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）患者 74 例，男 41 例，女 33例，年齡 24～67 歲，平均（41.8±9.2）歲；急性淋巴白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）62 例， 男 35 例， 女 27例，年齡 22～68 歲，平均（40.5±8.7）歲。 所有入選研究對象對該研究均知情同意，并簽署協(xié)議書。

1.2 方法

AML 組接受 MA 或 HA 化療方案 （米托蒽醌/高三尖杉酯堿聯(lián)合阿糖胞苷） 誘導(dǎo)緩解；ALL 組接受VDLP 化療方案（長春新堿、柔紅霉素、左旋門冬酰胺酶、潑尼松）誘導(dǎo)緩解，所有受試者均化療結(jié)束后3 d 內(nèi)抽取上午空腹靜脈血4 mL，EDTA-2K 抗凝，分別置入由異硫氰酸熒光素、多甲藻葉綠素蛋白、藻紅蛋白、別藻青蛋白免疫標(biāo)記的試管內(nèi)進(jìn)行免疫分型檢測， 每個(gè)試管均加入有核細(xì)胞100萬個(gè)，根據(jù)患者的病變特點(diǎn)選擇合適的單克隆抗體。 收集不少于10 萬個(gè)有核細(xì)胞進(jìn)行分析， 應(yīng)用EPICS-ALTRA型流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞收集，應(yīng)用BECKMAN-COULTER公司提供的配套軟件分析。 依據(jù)原始細(xì)胞抗原的表達(dá)情況（表達(dá)跨系與否、同步與否、強(qiáng)弱情況、是否丟失）判定是否MRD，MRD 含量≥0.01%則判斷為陽性，＜0.01%判斷為陰性。 對所有受試者進(jìn)行骨髓穿刺，抽取骨髓液涂片8張，吉姆薩-瑞氏染色，顯微鏡下分類200 個(gè)細(xì)胞，根據(jù)形態(tài)進(jìn)行分類計(jì)數(shù)，如原始、幼稚淋巴細(xì)胞占骨髓有核細(xì)胞的百分比＞5%時(shí)則判定為復(fù)發(fā)[6]。

以骨髓細(xì)胞學(xué)形態(tài)改變（增生1 級或2 級；原始細(xì)胞數(shù)量增加≥20%）作為MRD 診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，評價(jià)FCM 檢測對MRD 的診斷效能。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，該研究主要數(shù)據(jù)為計(jì)數(shù)資料， 以百分率表示，F(xiàn)CM 檢測的MRD 陽性和陰性患者復(fù)發(fā)率的比較采用校正χ2檢驗(yàn)， P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FCM 外周血檢測對MRD 的診斷效能

所有AL 患者中骨髓像檢測MRD 陽性92 例，其中陰性 AML 患者 49 例，ALL 患者 43 例，F(xiàn)CM 檢測對 AML 患者M(jìn)RD 的診斷的靈敏度、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、 準(zhǔn)確度分別為 98.0%、52.0%、80.0%、92.9%、82.4%；對ALL 患者M(jìn)RD 的診斷的靈敏度、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、 準(zhǔn)確度分別為 93.0%、63.2%、85.1%、80.0%、83.8。 見表 1、表 2。

表1 FCM 檢測AML 患者M(jìn)RD 的診斷情況Table 1 MRD diagnosis of AML patients detected by FCM

表2 FCM 檢測ALL 患者M(jìn)RD 的診斷情況Table 2 MRD diagnosis of ALL patients detected by FCM

2.2 AL 患者M(jìn)RD 陽性與復(fù)發(fā)率的關(guān)系

對 AL 患者隨訪 1 年，AML 組、ALL 組 MRD 陽性患者復(fù)發(fā)率 （73.5%、69.8%） 均高于 MRD 陰性患者 （32.0%、26.3%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 見表 3。

表3 AL 患者復(fù)發(fā)情況（%）Table 3 Recurrence of AL patients

3 討論

AL 患者是威脅人類健康的造血系統(tǒng)惡性腫瘤， 近年來隨著醫(yī)療水平的飛速提高和藥物研究不斷深入， 該病首次化療緩解率明顯提高， 絕大多數(shù)白血病細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)治療后能夠被殺死，但仍難以達(dá)到徹底清除的高度，仍有部分患者化療緩解后復(fù)發(fā)[7]。 MRD 的存在是AL 患者復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素， 化療后檢測MRD 水平對于評價(jià)療效、預(yù)后判斷均具有重要意義。目前，骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測是AL診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，也是療效評價(jià)的常用指標(biāo)，但骨髓穿刺取得的標(biāo)本僅反映該區(qū)域的骨髓情況， 且當(dāng)患者體內(nèi)白血病細(xì)胞含量超過1%才能檢測出來[8]。 雖然骨髓穿刺液中含有較高比例的白血病細(xì)胞 ， 但骨髓穿刺過程往往會發(fā)生血液稀釋并導(dǎo)致MRD 測定值降低，血液科醫(yī)師可能過低估計(jì)患者的MRD 水平，并可能由此導(dǎo)致臨床決策的失誤。 近年來的研究發(fā)現(xiàn)，AML 患者化療后白血病細(xì)胞在骨骼中的分布存在一定異質(zhì)性，因此，骨髓液MRD 檢測為陰性也有可能是骨髓穿刺未穿到白血病細(xì)胞駐留的部位所致[9]。

AL 患者M(jìn)RD 在外周血中會有所體現(xiàn)， 采集外周血進(jìn)行MRD 檢測可全面反映AL 患者的預(yù)后， 且外周血標(biāo)本獲取方便，創(chuàng)傷小，患者容易接受；檢測時(shí)干擾細(xì)胞少，分析MRD 異常免疫表型會更準(zhǔn)確。FCM 是一種綜合了電子學(xué)、細(xì)胞免疫學(xué)、細(xì)胞化學(xué)等多種學(xué)科技術(shù)的細(xì)胞檢測方法，具有檢測方便、速度快、敏感度和特異性高等優(yōu)勢，可在細(xì)胞水平辨認(rèn)白血病細(xì)胞的大小、顆粒和熒光特征，對AL 患者外周血中MRD 細(xì)胞進(jìn)行相對和絕對計(jì)數(shù)，是檢測 AL 患者 MRD 的理想手段[10-11]。 Zeijlemaker 等[12]研究也認(rèn)為應(yīng)用FCM 計(jì)數(shù)進(jìn)行外周血MRD 檢測可能替代骨髓液檢測，成為評價(jià)AML 患者化療后復(fù)發(fā)情況的有效方法。 有關(guān)學(xué)者[13]的研究對比分析了AL 患者外周血和骨髓液中的MRD 水平，發(fā)現(xiàn)不同病理類型、不同化療方案患者上述測定值可能會發(fā)生變化， 但二者會保持一定的比例關(guān)系。 另有研究[14]也認(rèn)為ALL 患者外周血和骨髓MRD檢測有較好的一致性，外周血MRD 檢測可用于ALL 患者預(yù)后的評價(jià)。 盡管AL 患者（尤其AML 患者）化療后白血病細(xì)胞在全身骨骼分布中存在異質(zhì)性，但只要MRD 細(xì)胞由骨髓釋放入血液，都可通過FCM 計(jì)數(shù)檢測出。

該研究結(jié)果顯示，AML 組、ALL 組 MRD 陽性患者復(fù)發(fā)率 （73.5%、69.8%） 均高于 MRD 陰性患者 （32.0%、26.3%）（P<0.05），與 Zeijlemaker 等報(bào)道相似：誘導(dǎo)治療 1年后的累計(jì)復(fù)發(fā)率，PB mrd 陰性患者為29%，PB mrd 陽性患者為 89% (P<0.001)。 mrd 陰性患者 3 年 OS 為 52%，mrd 陽性患者 3 年 OS 為 15% (P=0.034)。 有研究[15]檢測了115 例 AML 患者外周血 MRD 情況， 發(fā)現(xiàn)外周血 MRD 測定值較高的AML 患者長期預(yù)后相對較差。 該研究也發(fā)現(xiàn)MRD 陽性表達(dá)的AML、ALL 患者， 其復(fù)發(fā)率也顯著高于同組的MRD 陰性表達(dá)患者， 表明MRD 陽性可能與骨髓中白血病細(xì)胞的存在有密切關(guān)系， 但該研究隨訪時(shí)間較短，至隨訪結(jié)束仍有部分MRD 陽性患者骨髓細(xì)胞形態(tài)檢測未找到復(fù)發(fā)的充足依據(jù)。 到目前為止得出的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)已提示MRD 陽性的AL 患者存在高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，MRD 是反應(yīng)AL 患者預(yù)后的重要因素。相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)MRD 水平＞0.01%的AL 患者， 其3 年復(fù)發(fā)率是＜0.01%患者的3 倍以上，并認(rèn)為化療后MRD 檢測持續(xù)陰性可停止治療，如持續(xù)陽性則考慮進(jìn)一步治療。

綜上所述，F(xiàn)CM 診斷外周血MRD 具有較高的敏感性和準(zhǔn)確度，在AL 患者化療后復(fù)發(fā)的評價(jià)中具有較高的臨床價(jià)值。