許良 王楠 曾林如

[摘要] 目的 探討A型肉毒毒素在體外動物實驗中對兔趾伸肌腱成纖維細(xì)胞的增殖活性的抑制作用，以及對相關(guān)細(xì)胞因子TGF-β1和bFGF表達(dá)的影響。 方法 體外分離兔趾伸肌腱，培養(yǎng)肌腱成纖維細(xì)胞，采取CCK8實驗檢測A型肉毒毒素在不同濃度條件下對成纖維細(xì)胞活性的影響。ELISA試劑檢測肌腱成纖維細(xì)胞中TGF-β1和bFGF的表達(dá)含量。 結(jié)果 與對照組相比，不同濃度的A型肉毒毒素對肌腱成纖維細(xì)胞的增殖活性有不同程度的抑制作用，在30 U/mL濃度時，抑制作用較低濃度10 U/mL和高濃度50 U/mL更為明顯。采用ELISA實驗檢測標(biāo)本中TGF-β1和bFGF的表達(dá)含量。在三種A型肉毒毒素濃度條件下（10 U/mL、30 U/mL、50 U/mL），實驗組中TGF-β1的表達(dá)濃度均低于對照組。在濃度為30 U/mL時，濃度降低最為明顯（P<0.05）。而實驗組中bFGF的濃度均高于對照組，在濃度為30 U/mL時，濃度升高最為明顯（P<0.05）。 結(jié)論 A型肉毒毒素能夠明顯抑制體外培養(yǎng)的兔肌腱成纖維細(xì)胞的增殖活性，降低TGF-β1 的表達(dá)水平，提高 bFGF的表達(dá)水平，在適合的濃度下，作用強度達(dá)到高峰，改善肌腱粘連癥狀。

[關(guān)鍵詞] A型肉毒毒素;肌腱粘連;成纖維細(xì)胞;動物實驗;TGF-β1;bFGF

[中圖分類號] R62 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2020）24-0028-03

[Abstract] Objective To investigate the inhibitory effect of botulinum toxin type A on the proliferative activity of rabbit extensor tendon fibroblasts in vitro and the effect on related cytokines TGF-β1 and bFGF. Methods Rabbit extensor tendon was isolated in vitro， and tendon fibroblasts were cultured. CCK8 assay was used to detect the effect of botulinum toxin type A on fibroblast activity under different concentrations. ELISA reagent was used to detect the expression levels of TGF-β1 and bFGF in tendon fibroblasts. Results Compared with those of the control group， different concentrations of botulinum toxin type A had different inhibitory effects on the proliferation of tendon fibroblasts. The inhibitory effect at 30 U/mL was more obvious than that at 10 U/mL and at 50 U/mL. The expression levels of TGF-β1 and bFGF in the specimens were determined by ELISA. Under the three concentrations of botulinum toxin type A （10 U/mL， 30 U/mL，50 U/mL）， the expression concentration of TGF-β1 in the experimental group was lower than that in the control group. At the concentration of 30 U/mL， the concentration decrease was the most significant（P<0.05）. The concentration of bFGF in the experimental group was higher than that in the control group， and the concentration was the highest at the concentration of 30 U/mL（P<0.05）. Conclusion Botulinum toxin type A can significantly inhibit the proliferative activity of rabbit tendon fibroblasts， reduce the expression of TGF-β1 and increase the expression of bFGF. At a suitable concentration， the intensity of action reaches a peak and it improves tendon adhesion symptom.

[Key words] Botulinum toxin type A;Tendon adhesion; Fibroblasts; Animal experiment; TGF-β1; bFGF

肌腱損傷術(shù)后發(fā)生的粘連，會嚴(yán)重影響關(guān)節(jié)功能的恢復(fù)[1]。如何緩解或防止肌腱及腱周組織粘連，盡早恢復(fù)其生理功能，同時又不影響肌腱本身的愈合，成為臨床及科研研究的焦點。一方面需要提高肌腱縫合的操作技術(shù)[2]，另一方面，需要局部用藥抑制肌腱成纖維細(xì)胞的生長，減少瘢痕的產(chǎn)生，避免肌腱粘連[3]。

A型肉毒毒素最早在美容整形科被廣泛應(yīng)用，因其微創(chuàng)、高效、安全而備受青睞[4]。隨著研究的不斷深入，A型肉毒毒素被拓展應(yīng)用于修復(fù)各種皮膚缺損，抑制皮膚瘢痕增生，并取得了理想的效果。A型肉毒毒素局部注射能使瘢痕變軟變平，瘢痕增生明顯改善[5]。在細(xì)胞體外實驗中，發(fā)現(xiàn)A型肉毒毒素能抑制成纖維細(xì)胞的生長和增殖，減弱局部成纖維細(xì)胞膠原蛋白的合成能力，有效緩解瘢痕生長[6]。本研究旨在進(jìn)一步揭示A型肉毒毒素預(yù)防肌腱粘連的作用，擴(kuò)大其治療范圍，為臨床藥物防治肌腱粘連提供新方案，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

5只新西蘭兔，體重3～3.5 kg，雌性，由浙江大學(xué)動物實驗中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2010-0028。在清潔環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。注射用A型肉毒毒素（衡力BTX-A，100 U/支，國藥準(zhǔn)字3109 70037），TGF-β1和bFGF的ELISA檢測試劑盒（杭州沃森生物科技有限公司），胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液、四甲基偶氮唑鹽等、電熱恒溫水浴槽、電子天平、臺式離心機、全自動酶標(biāo)儀、倒置相差顯微鏡等。

1.2 方法

培養(yǎng)兔肌腱成纖維細(xì)胞，切取兔四肢趾伸肌腱，置于0.25%胰酶，4℃環(huán)境下24 h，打碎組織，加入0.25%Ⅰ型膠原酶，37℃環(huán)境孵育1 h，收集懸液，1000 rpm離心5 min，加入DMEM培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度至5×105/mL。在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每48小時換置培養(yǎng)液一次，細(xì)胞融合80%進(jìn)行接種。實驗選用第4代至第5代細(xì)胞。

按照A型肉毒毒素濃度分為四組：對照組（0 U/mL）、10 U/mL組、30 U/mL組、50 U/mL組。取A型肉毒毒素（100 U/支），每組樣本份數(shù)20例，加入2 mL DMEM/F-12稀釋為50 U/mL后，按梯度稀釋至濃度30 U/mL、10 U/mL。取兔肌腱成纖維細(xì)胞，1000 rpm離心5 min，重懸稀釋于細(xì)胞計數(shù)板下計數(shù)，鋪96孔板，每孔5000個細(xì)胞，每組6個復(fù)孔，48 h后棄上清，每孔加入200 μL 10% 的CCK8檢測液，37℃避光反應(yīng)1 h，450 nm處讀取各孔OD值。計算各組細(xì)胞的增殖活力，計算公式：細(xì)胞活力*（%）=[A（加藥）-A（空白）]/[A（0加藥）-A（空白）]×100%。采用兔TGF-β1和bFGF的ELISA試劑盒檢測兔肌腱成纖維細(xì)胞在不同濃度的A型肉毒毒素條件下，培養(yǎng)48 h后培養(yǎng)基上清液中TGF-β1和bFGF的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組內(nèi)比較采用配對樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩組間比較采用Tukey HSD方法。計數(shù)資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兔肌腱成纖維細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

細(xì)胞貼壁生長良好，細(xì)胞界限清楚，胞體飽滿，排列較為緊密，大多呈現(xiàn)放射狀走形，見封三圖1。

2.2 A型肉毒毒素對肌腱成纖維細(xì)胞活性的影響

在4種濃度的A型肉毒毒素作用下，CCK8檢測盒檢測細(xì)胞活力，肌腱成纖維細(xì)胞的吸光度（OD）值隨著濃度的增加而下降。30 U/mL組對細(xì)胞增殖活性的抑制效果最顯著。A型肉毒毒素濃度為10 U/mL、30 U/mL、50 U/mL時，檢測兔肌腱成纖維細(xì)胞的吸光度（OD）值，計算各組的細(xì)胞活力分別為（89.0±14.4）、（79.6±10.7）、（91.9±6.9），均低于對照組的（100.0±13.1），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），濃度為30 U/mL時，差異最為明顯，對細(xì)胞活力的抑制作用最強。見表1。

2.3 A型肉毒毒素對兔肌腱成纖維細(xì)胞中TGF-β1和bFGF表達(dá)的影響

在A型肉毒毒素作用下，成纖維細(xì)胞中的TGF-β1的表達(dá)呈現(xiàn)不同程度的抑制作用。30 U/mL組抑制作用最明顯，而成纖維細(xì)胞中的bFGF的表達(dá)呈增加趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

3 討論

外傷引起肌腱損傷在臨床工作中較為常見。盡管不斷改進(jìn)肌腱修復(fù)技術(shù)，肌腱粘連仍作為最常見的并發(fā)癥嚴(yán)重影響創(chuàng)傷后肌腱的功能康復(fù)[7]。肌腱粘連與肌腱愈合有著重要聯(lián)系，肌腱在修復(fù)愈合過程中形成粘連的原因包括：①外源性愈合，因成纖維細(xì)胞在肌腱斷端大量生長，造成肌腱與周圍組織緊密粘連，影響肌腱滑動[8]，這是粘連形成的主要因素;②由于炎性反應(yīng)導(dǎo)致周圍組織滲出增多，機化后粘連;③肌腱細(xì)胞自身增殖過程中與周圍組織形成粘連[9]。所以本實驗通過抑制肌腱的外源性愈合，減少肌腱成纖維細(xì)胞的大量增殖，以此來緩解肌腱粘連的癥狀，防治肌腱粘連。

肌腱在愈合的過程中，周圍組織會釋放各種細(xì)胞生長因子參與創(chuàng)傷修復(fù)，主要包括成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）等[10]。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1通過對TGFβ/Smads信號通路的干擾，來抑制肌腱成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，一定程度上阻斷肌腱粘連的產(chǎn)生途徑，在創(chuàng)傷后的肌腱粘連中作用顯著[11]。有實驗研究通過檢測增生性瘢痕組織及皮膚組織中的TGF-β1表達(dá)水平，大樣本統(tǒng)計對比發(fā)現(xiàn)TGF-β1 在瘢痕組織中的表達(dá)水平顯著高于皮膚組織[12]。而生長因子bFGF的作用卻不同，研究顯示，能有效促進(jìn)鞘管內(nèi)肌腱的愈合，并且抑制鞘管內(nèi)組織的粘連，緩解局部組織炎性反應(yīng)。Oryan A等[13]造模兔屈肌腱損傷模型，通過局部注射bFGF，發(fā)現(xiàn)其能一定程度上調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，抑制腱周組織增生粘連，增加斷端膠原分泌，改善肌腱纖維的排列方式，調(diào)整組織損傷后的結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)性能。盛加根等[14]細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)，局部使用bFGF及5-氟尿嘧啶在有效促進(jìn)雞屈肌腱愈合的同時能減輕肌腱粘連。因此，細(xì)胞生長因子TGF-β1和bFGF作為監(jiān)測肌腱粘連的重要參考指標(biāo)，參與肌腱外源性愈合中瘢痕組織的形成機制，而被臨床醫(yī)師及科研工作者關(guān)注。在藥物防治肌腱粘連的攻堅戰(zhàn)中，治療方案各有不同。Tan V等[15]通過使用COX1和COX2抑制劑布洛芬，抑制局部炎性反應(yīng)，防止肌腱修復(fù)后粘連的形成。Xia C等[16]利用6-磷酸果糖抑制TGF-β1和Ⅰ型膠原RNA的表達(dá)，有效防止粘連產(chǎn)生，同時對肌腱愈合無明顯影響。隨著研究的深入，各種方法的臨床應(yīng)用較為局限，肌腱粘連仍未得到有效解決。

A型肉毒毒素臨床主要應(yīng)用于皺紋的治療[17]，臨床神經(jīng)藥理毒理作用研究較為豐富。隨著研究的深入，治療范圍逐漸擴(kuò)大，用于治療皮膚大量瘢痕增生[18]，且對緩解燒傷后的組織瘢痕化效果明顯。于波等[19]在瘢痕局部注射A型肉毒毒素，有效減輕了患者早期瘙癢和輕度疼痛的癥狀，軟化皮膚瘢痕組織。同時，發(fā)現(xiàn)A型肉毒毒素可促進(jìn)體外培養(yǎng)的瘢痕成纖維細(xì)胞的凋亡[20]。彭旦生[21]建立兔耳緣皮膚瘢痕模型，發(fā)現(xiàn)A型肉毒毒素緩解兔耳瘢痕增生，抑制局部攣縮的作用，是通過抑制成纖維細(xì)胞增殖或促進(jìn)其凋亡，減少局部膠原的合成來實現(xiàn)的。

本研究發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)環(huán)境中，A型肉毒毒素對肌腱成纖維細(xì)胞的增殖活力會產(chǎn)生不同程度的抑制作用。在對照組中，兔肌腱成纖維細(xì)胞生長旺盛。當(dāng)A型肉毒毒素濃度為10 U/mL、30 U/mL、50 U/mL時，成纖維細(xì)胞鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)數(shù)目減少、胞體減小、形態(tài)不典型、增殖活力減弱，在30 U/mL濃度時，增殖活力抑制最為明顯。采用ELISA實驗測定各組標(biāo)本TGF-β1和bFGF表達(dá)含量。在三種A型肉毒毒素濃度條件下（10 U/mL、30 U/mL、50 U/mL），肌腱成纖維細(xì)胞中TGF-β1的濃度分別為0.68 pg/mL、0.64 pg/mL、0.74 pg/mL，均低于對照組濃度1.21 pg/mL（P<0.05）。在濃度為30 U/mL時，抑制作用最為明顯。肌腱成纖維細(xì)胞中bFGF的濃度分別為1.33 pg/mL、1.99 pg/mL、1.75 pg/mL，均高于對照組濃度1.31 pg/mL（P<0.05）。在濃度為30 U/mL時，促進(jìn)作用最為明顯。由本研究可知，A型肉毒毒素可在一定程度上降低肌腱成纖維細(xì)胞TGF-β1的表達(dá)水平，從而抑制I型膠原、纖維結(jié)合素及α-SMA的表達(dá)，減少了肌腱成纖維細(xì)胞向瘢痕組織的轉(zhuǎn)化，避免肌腱周圍瘢痕組織增生。同時，A型肉毒毒素能上調(diào)bFGF的表達(dá)水平，增加膠原蛋白的分泌，防止過量的細(xì)胞外基質(zhì)沉積，改善肌腱纖維的聚合和排列方式，抑制肌腱的粘連。A型肉毒毒素的作用效果并非隨著濃度的增加而遞增，在本研究中，當(dāng)濃度為30 U/mL時，效果最為顯著，能有效抑制成纖維細(xì)胞的增生而緩解肌腱粘連。

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（收稿日期：2019-07-16）