胡立華 張鑒穎 陳鵬

[摘要] 目的 探討微小RNA-22在食管癌患者血清中的異常表達(dá)及其臨床意義。 方法 45例食管癌患者血清標(biāo)本均來自黑龍江省醫(yī)院2018年1月～2019年3月的門診及住院患者，均經(jīng)病理證實(shí)。采血前患者均未接受放射治療和化學(xué)藥物治療。45名健康對(duì)照者血清標(biāo)本均來自健康體檢者。采用實(shí)時(shí)定量PCR（Real-time PCR，RT-PCR）法檢測(cè)食管癌患者和健康對(duì)照者血清中miRNA-22的表達(dá)水平。分析食管癌患者和健康對(duì)照者血清中的miRNA-22表達(dá)情況及食管癌患者血清miRNA-22表達(dá)水平與食管癌臨床病理特征之間的關(guān)系。 結(jié)果 86.67%（39/45）的食管癌患者血清中miRNA-22相對(duì)表達(dá)量明顯低于健康對(duì)照者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。T3、T4期患者血清中miRNA-22低表達(dá)率為93.3%（28/30），顯著高于T1、T2期患者的73.3%（11/15），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;且T分期越高，miRNA-22表達(dá)量越低，呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.523，P<0.05）;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者低表達(dá)率為96.0%（24/25），顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的75.0%（15/20），差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;而與患者的性別、年齡及腫瘤分化程度無明顯相關(guān)性（P>0.05）。 結(jié)論 miRNA-22在食管癌患者血清中的表達(dá)下調(diào)，且與食管癌的臨床病理特征密切相關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 微小RNA-22;食管癌;血清;TNM分期

[中圖分類號(hào)] R73 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-9701（2020）24-0013-04

[Abstract] Objective To investigate the abnormal expression of miRNA-22 in serum of patients with esophageal cancer and its clinical significance. Methods A total number of 45 serum samples were all collected from outpatients and inpatients with esophageal cancer who were treated in Heilongjiang Provincial Hospital from January 2018 to March 2019. All were confirmed by pathology. None of the patients were treated with radiotherapy and chemotherapy before blood collection. The serum samples of 45 healthy controls were all collected from healthy examinees. Real-time PCR（RT-PCR） method was used to detect the expression level of miRNA-22 in serum of patients with esophageal cancer and healthy controls. The expression of miRNA-22 in serum of patients with esophageal cancer and healthy controls， and the relationship between the expression level of serum miRNA-22 in patients with esophageal cancer and clinicopathological features of esophageal cancer were analyzed. Results The relative expression level of miRNA-22 in serums of 86.67%（39/45） of patients with esophageal cancer were significantly lower than those of healthy controls， with statistically significant differences（P<0.05）. The low expression rate of miRNA-22 in serum of patients with T3 and T4 esophageal cancer was significantly higher than that of patients with T1 and T2 esophageal cancer， which was 93.3%（28/30） and 73.3%（11/15）， respectively， with statistically significant difference（P<0.05）. A negative correlation was found as the higher the T stage， the lower the expression level of miRNA-22（r=-0.523， P<0.05）. The low expression rate of patients with lymph node metastasis was significantly higher than that of patients without lymph node metastasis， which was 96.0%（24/25） and 75.0%（15/20）， respectively， with statistically significant difference（P<0.05）. However， no significant correlations with gender， age and tumor differentiation of the patients were found（P>0.05）. Conclusion The expression of miRNA-22 in serum of patients with esophageal cancer is down-regulated and is closely related to the clinicopathological features of esophageal cancer.

[Key words] miRNA-22; Esophageal cancer; Serum; TNM staging

食管癌是常見的惡性腫瘤[1]。由于其早期缺乏特異性臨床表現(xiàn)，臨床上確診的食管癌患者多為中、晚期，5年生存率在10%左右。因此尋找敏感而特異的腫瘤標(biāo)記物及早期診斷，對(duì)降低食管癌患者的病死率非常重要。近來研究發(fā)現(xiàn)，微小核糖核酸（micro-RNA，miRNA）與腫瘤密切相關(guān)，是一種新的腫瘤標(biāo)志物。miRNA不僅在腫瘤組織、細(xì)胞中異常表達(dá)，在腫瘤患者血清中也有特征性的表達(dá)譜，特定的血清miRNA表達(dá)譜對(duì)腫瘤的診斷、分類、治療以及預(yù)后均有重要的價(jià)值[2]。本研究通過檢測(cè)微小核糖核酸-22（micro-RNA-22，miRNA-22）在食管癌患者及健康對(duì)照者血清中的表達(dá)，為探討miRNA-22在食管癌中的生物學(xué)功能及與腫瘤的關(guān)系提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

45例食管癌患者血清標(biāo)本均來自黑龍江省醫(yī)院2018年1月～2019年3月的門診及住院患者，其中男28例，女17例;年齡39～77歲，平均（58.6±3.1）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)[3]：（1）胃鏡下活檢病理證實(shí)食管鱗狀細(xì)胞癌者;（2）采血前均未接受放療、化療、生物治療等任何治療者;（3）患者及其家屬知情并且積極配合參與本項(xiàng)目。排除標(biāo)準(zhǔn)[4]：（1）合并其他腫瘤者。（2）伴隨其他嚴(yán)重慢性疾病者。臨床分期按國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）第7版TNM標(biāo)準(zhǔn)分期：Ⅰ期/Ⅱ期15例，Ⅲ期/Ⅳ期30例;病理分級(jí)：高、中分化癌19例，低分化癌26例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者25例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者20例。45名健康對(duì)照者血清標(biāo)本均來自健康體檢者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有標(biāo)本均獲患者知情同意。

1.2 方法

用無菌注射器抽取食管癌患者及健康對(duì)照者靜脈血5 mL，常溫放置30 min，1500×g離心7 min，吸取上層血清轉(zhuǎn)入另一無菌離心管，800×g離心l0 min，取上清。待檢血清在-80℃保存?zhèn)溆谩０碩rizol試劑盒說明書操作，提取血清總RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外分光光度儀檢RNA溶液，測(cè)A260/A280比值，計(jì)算RNA濃度和純度，取A260/A280比值在1.8～2.1者用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。取2 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為：16℃ 30 min，42℃ 45 min，85℃ 5 min。實(shí)時(shí)定量PCR（Real-time PCR，RT-PCR）檢測(cè)miRNA-22，miRNA-22PCR擴(kuò)增，上游引物：5'-AAGCTGCCA-GTTGAAGAACTGTA-3'，下游引物：5'-CTCGCTTC-GGCAGCACA-3'。反應(yīng)條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)反復(fù)3次，同時(shí)選取U6 snRNA為內(nèi)參照。U6內(nèi)參照上游引物：5'GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3'，下游引物：5'CGCTTC-ACGAATTTGCGTGTCAT3'。RT-PCR結(jié)果以Ct值表示，用2-ΔΔCt比較各樣品間miRNA-22的表達(dá)水平差異。

1.3 觀察指標(biāo)

比較食管癌組與健康對(duì)照組血清miRNA-22的水平變化及食管癌組miRNA-22水平與臨床病理特征的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計(jì)量資料組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管癌患者及健康對(duì)照者血清中miRNA-22的表達(dá)

對(duì)45例食管癌患者和45名健康對(duì)照者血清標(biāo)本中miRNA-22的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明：86.67%（39/45）的食管癌患者血清中miRNA-22相對(duì)表達(dá)量明顯低于健康對(duì)照者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=70.352，P<0.05）。

2.2 食管癌患者血清中miRNA-22的表達(dá)與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系

以食管癌患者血清中miRNA-22表達(dá)量的中位數(shù)為分界點(diǎn)，將食管癌患者分為低表達(dá)組和高表達(dá)組[5]，分析各組與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系（表1）。結(jié)果表明：T3、T4期食管癌患者血清中miRNA-22低表達(dá)率為93.3%（28/30），顯著高于T1、T2期食管癌患者的73.3%（11/15），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=65.964，P<0.05）;且T分期越高，miRNA-22表達(dá)量越低，呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.523，P<0.05）;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者低表達(dá)率為96.0%（24/25），顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的75.0%（15/20），差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=66.233，P<0.05）;而miRNA-22的低表達(dá)率與患者的性別、年齡及腫瘤分化程度無明顯相關(guān)性（P>0.05）。見表1。

3 討論

Lee RC等[6]于1993年發(fā)現(xiàn)了一個(gè)22個(gè)堿基的小分子RNA-lin-4，其不能編碼蛋白質(zhì)，但卻能抑制蛋白質(zhì)翻譯，抑制蛋白質(zhì)合成。隨后科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)了大量具有類似調(diào)控基因功能的小分子非編碼RNA，被稱為微小核糖核酸（microRNA，miRNA）。2004年Calin GA等[7]發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞之間，miRNA表達(dá)譜明顯不同，約50%miRNA基因組定位于腫瘤相關(guān)的基因脆性位點(diǎn)上，多數(shù)可抑制腫瘤細(xì)胞的表達(dá)。既往研究表明：微小核糖核酸-22（micro-RNA-22，miRNA-22）在食管癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)并與食管癌的臨床病理特征密切相關(guān)[8，9]。因?yàn)槔檬中g(shù)切除的標(biāo)本進(jìn)行分子生物學(xué)方面的檢測(cè)有一定的局限性，如標(biāo)本來源的限制、無法連續(xù)檢測(cè)及隨訪等，所以腫瘤患者外周血中循環(huán)miRNA的檢測(cè)成為關(guān)注的熱點(diǎn)。2008年Lawrie CH等[10]發(fā)現(xiàn)在彌漫性B細(xì)胞淋巴瘤患者的血清中miRNA-21表達(dá)水平很高，并證實(shí)其與無復(fù)發(fā)存活率增高密切相關(guān)。miRNA-21成為第一個(gè)血清miRNA標(biāo)志物，從此開啟了對(duì)血清中游離miRNA的研究。血清中游離miRNA的檢測(cè)具有損傷小、穩(wěn)定性良好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，可能成為新的腫瘤標(biāo)記物。如能將其應(yīng)用于臨床，可顯著提高腫瘤檢出率，促進(jìn)腫瘤診斷學(xué)和治療學(xué)的進(jìn)展。

miRNA在食管癌中的研究，主要集中在組織和細(xì)胞中。聶龍等[11]研究發(fā)現(xiàn)在食管癌組織中miRNA-155的相對(duì)表達(dá)降低，可能抑制了機(jī)體抗癌作用，從而促進(jìn)食管癌的發(fā)生與發(fā)展。蔣慶鋒等[12]研究指出食管癌組織中miRNA-802表達(dá)下調(diào)，并通過調(diào)控靶基因RAB23的表達(dá)參與食管癌的發(fā)生、發(fā)展。孟雪梅等[13]采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)食管癌及其相應(yīng)癌旁組織中miRNA -1299的表達(dá)水平，結(jié)果表明：miRNA-1299在食管癌組織中的表達(dá)水平明顯低于相應(yīng)的癌旁組織且與食管癌患者的臨床分期具有相關(guān)性。符佳等[14]的研究顯示：miRNA-127-3p在食管鱗狀細(xì)胞癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)均明顯低于癌旁正常組織及正常食管細(xì)胞。李彥樺等[15]采用qRT-PCR法證實(shí)在食管鱗癌組織中miRNA-320a低表達(dá)，而miRNA-181a-5p高表達(dá)，且其靶基因均為TGF-β1。目前，國(guó)內(nèi)一些學(xué)者已經(jīng)開始研究血清中游離miRNA的表達(dá)情況。謝子鈞等[4]研究表明食管癌患者血清中miRNA-10b的表達(dá)水平顯著低于健康體檢者。楊艷等[16]研究結(jié)果表明：食管癌患者血清中miRNA-451的表達(dá)水平明顯高于健康對(duì)照者，且miRNA-451的表達(dá)水平與食管癌患者的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。而馬箐等[3]研究表明：在食管鱗癌患者血清中miRNA-320c高表達(dá)，但與腫瘤TNM分期及腫瘤病理分化程度無明顯相關(guān)性。

本研究通過實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)45例食管癌患者及45名健康對(duì)照者血清中miRNA-22的表達(dá)情況，并對(duì)患者臨床病理參數(shù)進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果表明：食管癌患者血清中miRNA-22相對(duì)表達(dá)量明顯低于健康對(duì)照者（χ2=70.352，P<0.05），這一結(jié)果與既往研究miRNA-22在食管癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)相符[8，9]，提示miRNA-22在食管癌發(fā)生中具有抑癌基因的作用，血清miRNA-22可作為食管癌診斷的分子標(biāo)志物。本研究還發(fā)現(xiàn)，食管癌患者血清中miRNA-22低表達(dá)與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和高TNM分期（Ⅲ+Ⅳ）間具有明顯的相關(guān)性（P<0.05），且T分期越高，miRNA-22表達(dá)量越低，呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.523，P<0.05），提示miRNA-22的表達(dá)水平可以作為評(píng)價(jià)食管癌TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的一個(gè)輔助的評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)患者預(yù)后評(píng)估有一定的參考價(jià)值。

研究表明，miRNA-22在胃癌組織中的表達(dá)下調(diào)，且其過表達(dá)可通過轉(zhuǎn)錄因子Sp1抑制腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[17]。miRNA-22在食管癌中的過表達(dá)是否可抑制其浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移及其作用的機(jī)制需要進(jìn)一步研究。另外，食管良性腫瘤、Barrett食管及食管腺癌患者血清中miRNA-22的表達(dá)水平及食管癌患者血清中miRNA-22的表達(dá)水平與放化療敏感性之間的關(guān)系亦有待下一步開展。

綜上所述，miRNA-22在食管癌患者血清中的低表達(dá)與食管癌的發(fā)生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可能成為食管癌診斷及治療的新的分子生物學(xué)標(biāo)志。

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（收稿日期：2020-06-03）