李 丹，高 藝，馮 蕓，燕 婧，劉文奇

(1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西 延安 716000；2.延安市人民醫(yī)院普外科二病區(qū)，陜西 延安 716000)

胃癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，根據(jù)2018年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)，胃癌在世界范圍內(nèi)惡性腫瘤發(fā)病率居第5位，死亡率居第3位，東亞地區(qū)胃癌發(fā)病率居世界首位[1]。胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個多步驟、多因素的過程，受到多種因素的影響，由于缺乏典型的早期癥狀，大多數(shù)患者被明確診斷時已為晚期。因此尋找一種早期診斷或治療性胃癌的生物標(biāo)志物是非常必要的。雖然人們已經(jīng)對胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制進(jìn)行了大量的研究，但是識別新的胃癌檢測和治療靶點仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)[2]。

microRNAs(MiRNAs)是一種小的非編碼RNA，能識別特定的目標(biāo)mRNAs，通過與靶向mRNAs的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)結(jié)合，參與基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[3]。許多研究表明miRNAs在腫瘤的生物學(xué)行為中起著至關(guān)重要的作用，包括增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移和侵襲[4-6]。miR-149作為microRNAs中的一員，位于人類染色2q37.3。研究顯示miR-149在非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌中表達(dá)異常，可發(fā)揮抑癌作用[7-9]。惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡、影響患者預(yù)后的重要因素。有研究指出miR-149在腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲中發(fā)揮重要作用，王強(qiáng)，等[10]人的研究表明miR-149-5P在口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中低表達(dá)，并且通過靶向CDK6抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移。本試驗選取人胃癌細(xì)胞BGC-823和MKN28作為研究對象，檢測miR-149-5P在胃癌細(xì)胞BGC-823和MKN28中的表達(dá)情況，并在這兩個細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染miR-149-5P模擬物以及抑制劑，觀察其對胃癌細(xì)胞BGC-823和MKN28遷移的影響，從而探討miR-149-5P對胃癌生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

GES-1與BGC-823和MKN28細(xì)胞均來自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物醫(yī)學(xué)中心，實驗提取總RNA所用Trizol裂解液、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq TMⅡ均購自康潤生物公司，miR-149-5P mimics、NC、inhibitor、inhibitor-NC均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。轉(zhuǎn)染試劑購自Poly plus生物公司，抗體β-catenin、MMP2、 E-cadherin購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) GES-1采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，BGC-823和MKN28細(xì)胞采用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中添加10% FBS，將細(xì)胞置于5%CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3天換液，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.2 qRT-PCR Trizol法提取GES-1、BGC-823和MKN28細(xì)胞的總RNA,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟合成cDNA，采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒將cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測miR-149-5P在GES-1與BGC-823和MKN28細(xì)胞中的表達(dá)。研究中所使用的miR-149-5P qRT-PCR引物委托北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行合成。序列如下：正向引物：5′-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3′，反向引物：5′-TGCTTCTGGCTCCGTGTCTT-3′。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染分4組：miR-149-5P mimics組、NC組、inhibitor組和inhibitor-NC組。Mimics序列：5′-UCUGGCUCCGUGUCUUCACUCCC-3′，5′-GAGUGAAGACACGGAGCCAGAUU-3′；NC序列：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′；inhibitor序列：5′-GGGAGUGAAGACACGGAGCCAGA-3′；inhibitor-NC序列：5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′。根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取對數(shù)生長期生長良好的BGC-823和MKN28細(xì)胞，以適當(dāng)密度鋪至6孔板，轉(zhuǎn)染24 h后，提取RNA，采用qRT-PCR檢測其轉(zhuǎn)染效果。

1.2.4 細(xì)胞劃痕實驗 用記號筆在6孔板的底部均勻劃3條直線，取對數(shù)生長期良好的細(xì)胞接種在6孔板培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時轉(zhuǎn)染4 h后用10 μL白色槍頭在培養(yǎng)基底部劃線。PBS洗去脫落的細(xì)胞，采集0 h圖像。然后加入2 mL含1%FBS的培養(yǎng)基放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，分別采集24 h和48 h圖像。觀察過表達(dá)或抑制miR-149-5P對BGC-823和MKN28細(xì)胞遷移能力的影響。

1.2.5 Transwell實驗 將生長狀態(tài)良好的細(xì)胞接種到24孔板中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時轉(zhuǎn)染，24 h后消化離心收集細(xì)胞，用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計數(shù)，在Transwell小室的上室接種3×105個細(xì)胞，細(xì)胞懸液體積為200 μL，(不含F(xiàn)BS)。在小室的下室加入600 μL含10%FBS的培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后用4%多聚甲醛將小室固定15 min，1%結(jié)晶紫染液染色30 min后取出小室用蒸餾水洗滌，拿棉簽擦去未穿過膜的細(xì)胞。顯微鏡下可以觀察到穿過膜的細(xì)胞被染成紫色，采集圖像。最后將拍照后的小室放入未使用過的24孔板培養(yǎng)孔中，加入600 μL二甲基亞砜(DMSO)振蕩30 min溶解結(jié)晶紫，將溶有結(jié)晶紫的DMSO轉(zhuǎn)移到96孔板中，每孔200 μL，在570 nm測吸光值。檢測過表達(dá)或抑制miR-149-5P后BGC-823和MKN28細(xì)胞的遷移能力。

1.2.6 Western blot實驗 取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，以適當(dāng)密度鋪至6孔板，轉(zhuǎn)染48 h后，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，100℃使蛋白變性5 min。配置10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳,取20 μg蛋白上樣，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜150 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉40 min。分別按1∶1000配置β-catenin、MMP2、E-cadherin，1∶5000配置β-actin的一抗工作液(TBST溶液進(jìn)行稀釋)，室溫孵育1 h，4℃過夜，TBST洗膜三次，每次10 min。將PVDF膜浸于二抗孵育液中，正面朝上，室溫?fù)u床上孵育60 min，棄掉二抗孵育液，TBST洗膜三次，每次10 min。配置化學(xué)發(fā)光劑(A液∶B液=1∶1)顯影，用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS25統(tǒng)計軟件分析，應(yīng)用Student′st檢驗比較處理組和對照組間的差異。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-149-5P在GES-1與BGC-823和MKN28細(xì)胞中的表達(dá)

qRT-PCR檢測miR-149-5P在GES-1與BGC-823和MKN28細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示，與GES-1細(xì)胞相比，miR-149-5P在BGC-823和MKN28細(xì)胞中的表達(dá)明顯降低(P<0.01，見圖1)。

2.2 miR-149-5P mimics和inhibitor轉(zhuǎn)染效率檢測

qRT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染mimics后，BGC-823和MKN28細(xì)胞中miR-149-5P表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，而轉(zhuǎn)染inhibitor后，miR-149-5P在BGC-823細(xì)胞和MKN28細(xì)胞中的表達(dá)水平下降(P<0.01，見圖2)。

2.3 細(xì)胞劃痕實驗驗證miR-149-5P對BGC-823和MKN28細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實驗結(jié)果顯示：在BGC-823和MKN28細(xì)胞中，相較于對照組，轉(zhuǎn)染mimics后細(xì)胞的遷移能力明顯降低；當(dāng)轉(zhuǎn)染inhibitor后，相較于對照組，BGC-823和MKN28細(xì)胞的遷移能力升高，但是趨勢不是非常明顯，見圖3、4。

2.4 Transwell實驗驗證miR-149-5P對BGC-823和MKN28細(xì)胞遷移能力的影響

Transwell實驗結(jié)果顯示：在BGC-823和MKN28細(xì)胞中，相較于對照組，轉(zhuǎn)染mimics后穿過小室的細(xì)胞數(shù)明顯減少，細(xì)胞的遷移能力明顯降低(P<0.01)；當(dāng)轉(zhuǎn)染inhibitor后，相較于對照組，穿過小室的BGC-823細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.01)，細(xì)胞的遷移能力升高。而與對照組相比，穿過小室的MKN28細(xì)胞數(shù)沒有明顯變化(見圖5、圖6)。

2.5 Western Blot實驗檢測干擾miR-149-5P后BGC823和MKN28細(xì)胞中β-catenin、MMP2和E-cadherin的蛋白表達(dá)

Western Blot實驗結(jié)果顯示：與對照組相比，轉(zhuǎn)染mimics后，BGC-823和MKN28細(xì)胞中β-catenin和MMP2蛋白表達(dá)明顯降低，E-cadherin蛋白表達(dá)明顯升高；而轉(zhuǎn)染inhibitor后，相比于對照組，BGC-823細(xì)胞中β-catenin和MMP2蛋白表達(dá)升高，E-cadherin蛋白表達(dá)降低，但MKN28細(xì)胞中β-catenin、MMP2和E-cadherin的蛋白表達(dá)沒有明顯變化，見圖7。

3 討論

胃癌是由胃粘膜上皮細(xì)胞衍生而來的惡性腫瘤之一，隨著醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，胃癌的發(fā)病率呈下降趨勢，但仍居我國惡性腫瘤前列[11]。由于在胃癌早期缺乏高靈敏度及特異度的指標(biāo)，部分患者確診時已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，而轉(zhuǎn)移是臨床治療胃癌的最大挑戰(zhàn)之一，也是患者生存率下降的主要原因。因此,如何有效預(yù)防與治療胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移成為延長患者生存期、改善預(yù)后的重要基礎(chǔ)。隨著腫瘤生物學(xué)的深入研究及分子技術(shù)水平的不斷提高，大量研究表明miRNA的異常表達(dá)與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有文獻(xiàn)報道m(xù)iRNA-452在胃癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和遷移，發(fā)揮癌基因的作用[12]。miR-139在胃癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞生長，降低MMP11在胃癌微環(huán)境中的轉(zhuǎn)移，發(fā)揮抑癌基因的作用[13]。Xu，等[14]研究發(fā)現(xiàn)miR-149在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，過表達(dá)miR-149可以抑制細(xì)胞遷移和侵襲，且miR-149可以靶向轉(zhuǎn)錄因子FOXM1抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移侵襲。Jin，等[15]發(fā)現(xiàn)miR-149在腎癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)。與對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-149模擬物后腎癌786-O和ACHN細(xì)胞遷移能力明顯減弱，說明miR-149可以抑制腎癌細(xì)胞遷移。在乳腺癌中，Dong，等[16]人的實驗結(jié)果證明miR-149靶向GIT1抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移。然而也有研究發(fā)現(xiàn)miR-149在一些腫瘤中高表達(dá)，發(fā)揮癌基因作用。Shen，等[17]發(fā)現(xiàn)miR-149在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá)，通過靶向caspase-2促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。Bellazzo，等[18]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-149-3P后可以抑制DAB2IP基因，通過激活NF-KB信號通路，促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力。以上研究說明miR-149參與調(diào)控惡性腫瘤細(xì)胞的遷移過程。

在本研究中，我們選擇胃癌BGC-823和MKN28細(xì)胞進(jìn)行實驗，從而研究miR-149-5P對胃癌細(xì)胞BGC-823和MKN28遷移能力的影響。首先我們采用qRT-PCR方法檢測miR-149-5P在GES-1與BGC-823和MKN28細(xì)胞中的表達(dá)，研究結(jié)果顯示相比于對照組，miR-149-5P在BGC-823和MKN28細(xì)胞中的表達(dá)明顯降低。隨后我們轉(zhuǎn)染miR-149-5P mimics和inhibitor，qRT-PCR結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-149-5P mimics能夠顯著促進(jìn)miR-149-5P的表達(dá)，而miR-149-5P inhibitor的轉(zhuǎn)染可以抑制其表達(dá)。細(xì)胞劃痕實驗和Transwell實驗結(jié)果也表明過表達(dá)miR-149-5P后胃癌細(xì)胞BGC-823和MKN28遷移能力減弱，提示miR-149-5P可以抑制胃癌BGC-823和MKN28細(xì)胞遷移。而抑制miR-149-5P后BGC-823細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)，但MKN28細(xì)胞的遷移并沒有明顯變化，這可能是因為miR-149-5P在MKN28細(xì)胞中表達(dá)較低的原因。β-catenin是細(xì)胞內(nèi)的一種多功能蛋白，通過與細(xì)胞骨架的相互作用，協(xié)助細(xì)胞對胞外信號作出反應(yīng)，它作為Wnt信號通路中的核心調(diào)控蛋白主要參與細(xì)胞黏附過程[19]。Wnt/β-catenin信號通路可以誘導(dǎo)上皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，細(xì)胞核中的β-catenin表達(dá)升高可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移能力，也有研究表明Wnt/β-catenin信號通路可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖及遷移[20]。基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)可以降解細(xì)胞外基質(zhì)，其高表達(dá)促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。E-cadherin在正常上皮組織中具有維持細(xì)胞間緊密連接、限制細(xì)胞運(yùn)動和轉(zhuǎn)移的作用，其高表達(dá)可以抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。我們用Western Blot實驗檢測轉(zhuǎn)染miR-149-5P mimics或inhibitor后BGC-823和MKN28細(xì)胞中β-catenin、MMP2和E-cadherin蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，相比于對照組，轉(zhuǎn)染mimics后,BGC-823和MKN28細(xì)胞中β-catenin和MMP2蛋白表達(dá)降低，E-cadherin的蛋白表達(dá)升高；轉(zhuǎn)染inhibitor后BGC-823中β-catenin和MMP2蛋白表達(dá)升高，E-cadherin的蛋白表達(dá)下調(diào)，而MKN28細(xì)胞中E-cadherin、β-catenin和MMP2蛋白表達(dá)水平并無明顯變化，這也許和miR-149-5P在MKN28細(xì)胞中表達(dá)較低有關(guān)。綜述所述，實驗結(jié)果表明miR-149-5P抑制胃癌細(xì)胞BGC-823和MKN28的遷移，為后續(xù)深入研究miR-149-5P的靶基因及其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ)。