閆 可,吳從嚴(yán),戴純剛,趙海峰,王為華,趙耀東?,朱文昱?,黃 強(qiáng)

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州科技城醫(yī)院 神經(jīng)外科,江蘇 蘇州 215153;2.南京醫(yī)科大學(xué)上海市第一人民醫(yī)院 神經(jīng)外科,上海 200080;3.南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州科技城醫(yī)院 病理科,江蘇 蘇州 215153;4.蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)外科,江蘇 蘇州 215004)

轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白( green fluorescent protein,GFP)基因的近交系裸小鼠(GFP 裸小鼠)是由蘇州大學(xué)黃強(qiáng)課題組研發(fā)的[1],已在腦膠質(zhì)瘤移植實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn), GFP 裸小鼠的腦組織和細(xì)胞因高表達(dá)GFP, 在示蹤宿主源性腫瘤微環(huán)境( Tumor microenvironment,TME) 方面,不需要加熒光示蹤劑而能直接起到清楚的示蹤作用[2-7],能很好地證明TME 中的巨噬細(xì)胞,樹(shù)突狀細(xì)胞,少突膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮等細(xì)胞,在變成腫瘤相關(guān)細(xì)胞的過(guò)程中,通過(guò)細(xì)胞融合而惡變,重構(gòu)成更加異質(zhì)的TME;但在我們正在進(jìn)行的顱骨成形研究的GFP 裸小鼠骨細(xì)胞中,是否也能在示蹤新骨形成方面起重要作用仍是未知。 本文提出這個(gè)問(wèn)題,是由于發(fā)現(xiàn)GFP 新生裸小鼠的顱骨細(xì)胞,在短期培養(yǎng)中,見(jiàn)到成骨前體細(xì)胞有強(qiáng)大的擴(kuò)增和分化能力,除了能在熒光顯微鏡下定性GFP 的局部位置和熒光強(qiáng)弱,還能在拉曼/ 多光子顯微鏡下進(jìn)行量化,有望為下一步用于顱骨成形研究中對(duì)成骨和破骨細(xì)胞進(jìn)行甄別和調(diào)控。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

出生后3 d 的GFP 裸小鼠( Foxn1nu.B6-CAGEGFP / SU,SPF 級(jí))6 只,無(wú)關(guān)性別,體重約3 g,購(gòu)自并飼養(yǎng)在蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(蘇)2018-0006][ SYXK(蘇)2017-0043],本實(shí)驗(yàn)經(jīng)蘇州科技城醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(IRB2018019),并嚴(yán)格遵循 “3R” 原則給與人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

細(xì)胞培養(yǎng)箱(MCO-18AC,Sanyo 日本);倒置顯微鏡( CKX41, Olympus 日本), 熒光顯微鏡( DM2500, Leica 德國(guó)); BMP-6 抗體( AB15640,abcam);CD11c 抗體(AF1396,碧云天);CD68 抗體( GK600710, 基因科技); CD206 抗體( 141711,BioLegend);DAB 試劑盒( GK347010,基因科技);RPIM1640 培養(yǎng)基( AE26543277,HyClone);離心機(jī)( TDZ5-WS, BIORIDGE ); RPIM1640 培養(yǎng)基(AE26543277,HyClone);胎牛血清(1616756,BI);青/ 鏈霉素(15140163,gibco);細(xì)胞培養(yǎng)板(corning,60 mm);12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板(corning);15 mL 離心管(corning);移液槍(Thermo);超凈臺(tái)(蘇州凈化)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)方法

參照陳潔等[8]的方法,加以改良,簡(jiǎn)要過(guò)程如下:(1)乳鼠脫頸處死,75%乙醇消毒全身,置于超凈臺(tái)上,剪開(kāi)頸背及頭頂皮膚,取雙側(cè)頂骨,保留骨膜,放入含有青/ 鏈霉素的PBS 溶液中,剪成1 mm2大小的骨片,直接接種于含有10%胎牛血清及青/鏈霉素的RPMI1640 培養(yǎng)基中,在5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng);(2) 待細(xì)胞移行出骨片貼培養(yǎng)皿壁生長(zhǎng)后用消毒鑷子夾出骨片,繼續(xù)培養(yǎng)到布滿(mǎn)皿壁90%時(shí),用0.25% 胰酶消化3 min,得到原代培養(yǎng)細(xì)胞P0;(3)P0 按1 ∶1傳代,每3 d 換液1 次,待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)90%時(shí),收獲到的細(xì)胞為P1;(4)P2 參照P1 培養(yǎng)和收集。 P0,P1 和P2 均在液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 細(xì)胞免疫化學(xué)染色

被檢細(xì)胞放入加有圓形載玻片的12 孔板內(nèi),待細(xì)胞爬滿(mǎn)玻片后,用PBS 潤(rùn)洗3 次,4%多聚甲醛溶液室溫固定20 min,后續(xù)簡(jiǎn)要過(guò)程如下:(1) 0.5%TritonX-100 室溫通透20 min,PBS 清洗三次。 (2)3%過(guò)氧化氫溶液清除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,室溫15 min,PBS 清洗。 (3)10%山羊血清室溫封閉30 min。(4)吸出血清,孵一抗,4℃過(guò)夜。 (抗體工作濃度:BMP-6,1 ∶200;CD11C,1 ∶150;CD68,1 ∶100;CD206,1 ∶100)(5)PBS 沖洗3 次,室溫孵二抗30 min,后用PBS 沖洗。 (6) DAB 光鏡下顯色2 ～5 min, 棄去DAB,PBS 沖洗數(shù)次。 (7) 蘇木精染核15 s,自來(lái)水沖洗玻片。 (8)無(wú)水乙醇脫水3 min 共3 次,中性樹(shù)膠封片。

2 結(jié)果

2.1 P0～P2 細(xì)胞和離體骨瓣?duì)顟B(tài)

游離骨片置于培養(yǎng)皿底7 d,在骨片中央和邊緣能見(jiàn)到細(xì)胞陸續(xù)移行出來(lái),沿皿壁生長(zhǎng),隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),細(xì)胞數(shù)量不斷增多,排裂緊,在低倍鏡下呈鵝卵石樣,在高倍鏡下以長(zhǎng)纖維和星形為主,白光和熒光鏡下所見(jiàn)到的形態(tài)基本一致。 到6 ～8 d細(xì)胞布滿(mǎn)皿底的90%時(shí)收獲(P0),接著又繼續(xù)傳了二代(P1 和P2),傳代時(shí)間分別為8 d 和15 d,如果再往下傳,細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)是越來(lái)越慢,因此結(jié)束細(xì)胞傳代實(shí)驗(yàn),并把收獲的細(xì)胞于液氮凍存。

從細(xì)胞形態(tài)看,隨著傳代次數(shù)增多,向終末分化細(xì)胞增加,甚至老化會(huì)加重。 如果將取出的骨片繼續(xù)培養(yǎng)(骨片傳代),仍可見(jiàn)到細(xì)胞從骨片邊緣移行出來(lái)繼續(xù)生長(zhǎng),說(shuō)明培養(yǎng)液中存放的離體骨片本身也是活著的,也可傳代,但這屬于類(lèi)器官培養(yǎng),難度更大,有待今后研究。 詳見(jiàn)圖1。

2.2 標(biāo)志蛋白表達(dá)

(1)骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-6)的免疫復(fù)合物為棕色,在鏡下見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞散在分布于細(xì)胞群各處,所占比例不高(圖2A 紅箭頭),但表形很有特征性,免疫復(fù)合物主要在細(xì)胞質(zhì),組成細(xì)胞骨架(圖2A 黃箭頭),也有些沉積于染色質(zhì)(圖2A 綠箭頭)。 更具特征性的是在胞外也有沉積,跨越多個(gè)細(xì)胞核,容易誤判在多核細(xì)胞中表達(dá)(圖2A 藍(lán)箭頭);

(2)巨噬細(xì)胞甘露糖受體1(CD206) 的深棕色免疫復(fù)合物也只存在于細(xì)胞群中的少數(shù)細(xì)胞中,特征是只在細(xì)胞漿表達(dá),復(fù)合物呈顆粒狀(圖2B);

(3)CD68 的表達(dá)與CD206 相似,但CD11c 未見(jiàn)表達(dá)(圖2C 和圖2D)。

3 討論

3.1 對(duì)正常成骨細(xì)胞系的評(píng)價(jià)

這是指已具永生化潛能的細(xì)胞,就顱骨而言:有Kodama 等[9]和Sudo 等[10]分別于1981 和1983年報(bào)告了新生小鼠顱骨細(xì)胞體外連續(xù)傳代培養(yǎng)至數(shù)十代,以堿性磷酸酶陽(yáng)性表達(dá),礦化細(xì)胞聚集,形成骨的雛形為建系標(biāo)準(zhǔn); 其中Sudo 等[10]建立的MC3T3 細(xì)胞系至今已成為商品被廣泛應(yīng)用。 可是1997 年Nakayama 等[11]從p53 缺陷小鼠的顱骨中建立MMC2 細(xì)胞系時(shí)指出,在他之前的細(xì)胞系幾乎都是反復(fù)傳代,獲得永生化基礎(chǔ)上建立的,這種永生化與未檢測(cè)的相關(guān)基因突變有關(guān)。 他報(bào)告的MMC2成骨細(xì)胞系的染色體已是異倍體,所幸小鼠致瘤試驗(yàn)陰性,他的結(jié)論是MMC2 的永生化,除了與p53缺陷相關(guān),不排除還有其它異?；騾⑴c。 2004年,Kadowaki 等[12]從新生的GFP 轉(zhuǎn)基因小鼠的顱骨中分離出成骨細(xì)胞,連續(xù)傳26 代后建立了自發(fā)綠色熒光的C3 細(xì)胞系,再通過(guò)腺病毒轉(zhuǎn)染BMP-2 于C3 細(xì)胞,用于4 mm 直徑圓形缺損顱骨的修補(bǔ),在熒光鏡下明確顯示,荷BMP-2 的GFP+細(xì)胞是形成新骨的主體。 同樣,除了通過(guò)熒光示蹤更加直接證明C3 細(xì)胞的成骨作用,但C3 基因型是否有改變不得而知。 總之,永生化細(xì)胞系如果作為治療的工具細(xì)胞,用于改善顱骨成形術(shù)的預(yù)后,應(yīng)注意致癌事件的發(fā)生。

3.2 對(duì)短期培養(yǎng)的成骨細(xì)胞評(píng)價(jià)

這里指來(lái)自生長(zhǎng)發(fā)育中的新生小鼠顱骨細(xì)胞,培養(yǎng)早期的擴(kuò)增能力不亞于成骨細(xì)胞系,不存在致瘤性,用于細(xì)胞接種時(shí),根據(jù)所處的環(huán)境可向不同方向分化,評(píng)價(jià)其優(yōu)劣的標(biāo)準(zhǔn)是看這個(gè)群體中的前體細(xì)胞占有率和亞群細(xì)胞的類(lèi)型。 從本文報(bào)告的結(jié)果來(lái)看(圖2),至少有與骨再生高度相關(guān)的成骨前體細(xì)胞和巨噬細(xì)胞(macrophages,M) 兩種亞群細(xì)胞標(biāo)志蛋白陽(yáng)性,不妨探討一下潛在的研究?jī)r(jià)值。已知骨再生有膜內(nèi)成骨和軟骨內(nèi)成骨,前者見(jiàn)于骨折間隙小的扁平骨,后者見(jiàn)于間隙大的長(zhǎng)骨[13],無(wú)論那種,M 都必須參與修復(fù)[14-16]。 在修復(fù)初期,M的作用是吞噬骨折部位的壞死組織和細(xì)胞碎片,后期募集間充質(zhì)干細(xì)胞和血管祖細(xì)胞[17],這種功能轉(zhuǎn)變稱(chēng) “極化”,炎癥性M 又稱(chēng)為經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞(M1);在再生中激活的M 稱(chēng)選擇性激活巨噬細(xì)胞(M2),M1 / M2 的出生地均在骨髓(M0),根據(jù)骨折當(dāng)時(shí)建立穩(wěn)態(tài)環(huán)境需要決定對(duì)M0 是否進(jìn)行征集。本文檢測(cè)到的CD68+細(xì)胞可定性為M1 細(xì)胞[18],同樣CD206+細(xì)胞可定性為M2 細(xì)胞[19],結(jié)合還檢測(cè)到的BMP-6+細(xì)胞可定性為成骨前體細(xì)胞[20]。 有鑒于此,本文的P0,P1 和P2 有望作為工具細(xì)胞用于骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)。 不得不指出的是, 代表M0 的CD11c+細(xì)胞[21]未被檢測(cè)到,究其原因可能與骨片離體培養(yǎng),脫離了機(jī)體的骨髓環(huán)境有關(guān)。

圖1 新生小鼠顱骨細(xì)胞培養(yǎng)Note.A (naked eye), Mice skull fragments for osteocyte culture.B (inverted microscope), The white area around the bone plate showed that the bone cells began to proliferate.As the culture time increased, the proliferation area gradually expanded and extended from the bone plate to the bottom of the dish.C ( inverted microscope), Amplification of red B-frame was the bone cells cultured for 2 days.P0 ～P2 ( inverted microscope) is a continuous passage cell, P0 ( Zero generation), P1 ( First generation ), P2 ( Second generation ) They have good proliferators, and their cells are like pebble-like; The morphology of D, E and F cells under different multiples of fluorescence in the same field of vision.E and G were compared under the same multiple fluorescence to daylight.The two forms were basically the same, except that the cytoplasm of e showed more clearly, and in the case of further magnification, F could clearly show pseudo-foot and pseudo-filament.Figure 1 Culture of skull cells in newborn mice