李曉波,王 吉,付 瑞,王莎莎,王淑菁,李 威,秦 驍,黃宗文,賀爭鳴,岳秉飛?,林更濤

(1.中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動物資源研究所,北京 102629; 2.東營市疾病預(yù)防控制中心,山東 東營 257091)

由新型冠狀病毒引起的肺炎,截至2020 年6 月24 日,全球感染病例近千萬,死亡近50 萬人。 我國在較短時間內(nèi)完成了該病毒的鑒定和基因組測序工作,國際病毒專家小組將此次爆發(fā)的新型冠狀病毒命名為SARS-CoV-2[1]。 冠狀病毒為有包膜的單股正鏈RNA 病毒,具有跨物種傳播和宿主適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)。Enserink 等在國際上首次提出2003 年的SARS 冠狀病毒來自蝙蝠,后通過果子貍傳播給人類[2]。 本次新型冠狀病毒溯源及可能的動物中間宿主還不明確,其在除了人類以外的動物中感染情況還不清楚,目前疫情防控重點(diǎn)主要放在人上,而對動物的防控是盲區(qū),動物體內(nèi)如果存在病毒會對疫情的防控產(chǎn)生巨大威脅。 本研究對實(shí)驗(yàn)小鼠、大鼠、豚鼠、兔及犬中新型冠狀病毒的感染情況進(jìn)行了初步調(diào)查,為實(shí)驗(yàn)動物相關(guān)從業(yè)人員的防護(hù)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),同時對防范新冠病毒的傳播提供一定的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動物血清均來自2020 年各實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)單位送檢樣品[SCXK(京)2017-0005][SYXK(京)2017-0013],其中小鼠血清90 份,編號M1 ～M90;大鼠血清38 份,編號R1 ～R38;豚鼠血清20 份,編號G1～G20;兔血清27 份,編號Ra1 ～Ra27;犬血清5 份,編號C1 ～C5,詳細(xì)信息見表1,已通過本院倫理審批(中檢動(福)第2019(A)001 號)。

1.2 主要試劑與儀器

新型冠狀病毒( SARS-CoV-2) 雙抗原夾心ELISA 抗體檢測試劑盒為洛陽普泰生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)( 2019 獸藥GMP 證字16016 號), 批號:E22A2002S。 酶 標(biāo) 儀( 美 國Thermo 公 司, 型 號MK3);恒溫培養(yǎng)箱(日本三洋公司,型號MIR-262)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 ELISA 測定實(shí)驗(yàn)動物血清中新型冠狀病毒抗體

按照ELISA 試劑盒的操作說明檢測實(shí)驗(yàn)動物血清樣品中的新型冠狀病毒抗體,具體步驟如下:

a.加樣:取抗原包被板,每板設(shè)陰性對照3 孔,陽性對照2 孔和空白對照1 孔,分別在相應(yīng)孔中加入待測樣品100 μL,陰、陽性對照每孔加入50 μL,記錄樣品加樣順序。

b.溫育:封板膜封板,37℃溫育30 min。

c.洗板:揭掉封板膜,每孔加滿洗液,靜置30 s,棄掉,重復(fù)洗板5 次,最后一次盡量扣干。

d.加酶:每孔加入酶標(biāo)試劑100 μL,空白孔除外,37℃溫育30 min。

e.洗板:同步驟c。

f.顯色:每孔加入顯色劑A、B 液各50 μL,輕輕振蕩混勻,37℃避光顯色15 min。

g.測定:每孔加入終止液50 μL,輕輕振蕩混勻,設(shè)定酶標(biāo)儀測定波長450 nm,用空白孔調(diào)零后測定各孔A 值。

1.3.2 結(jié)果判定

陰性對照孔A 值<0.1,陽性對照孔A 值>0.19,實(shí)驗(yàn)成立;臨界值= 0.16+陰性對照孔A 值均值(陰性對照孔低于0.03 按0.03 計算),樣品A 值≥臨界值判為新冠病毒抗體陽性,樣品A 值<臨界值判為新冠病毒抗體陰性。

2 結(jié)果

ELISA 結(jié)果見表2,陽性對照均值為0.588,陰性對照均值為0.006,實(shí)驗(yàn)成立;計算臨界值= 0.19,根據(jù)臨界值判斷90 份小鼠、38 份大鼠、20 份豚鼠、27 份兔及5 份犬血清樣本中新冠病毒抗體均為陰性。

3 討論

ELISA 檢測病毒抗體是實(shí)驗(yàn)動物國家標(biāo)準(zhǔn)常用的病毒檢測方法。 ELISA 具有靈敏度高,特異性好,操作簡便等特點(diǎn),對動物血清中病毒抗體檢測可顯示動物的既往感染情況,并可避免病毒潛伏感染造成的核酸檢測假陰性結(jié)果。 近期北京新增多個病例核酸檢測陰性,而抗體檢測陽性,均可能由于人體免疫系統(tǒng)對病毒進(jìn)行了一定程度的清除,此時對咽拭子樣本進(jìn)行核酸檢測就可能出現(xiàn)核酸檢測結(jié)果陰性。

本研究采用的ELISA 檢測試劑盒來自洛陽普泰生物技術(shù)有限公司,該公司通過了獸藥GMP 認(rèn)證(2019 獸藥GMP 證字16016 號)。 試劑盒采用雙抗原夾心法檢測病毒抗體,特異性良好,與小鼠肝炎病毒、大鼠冠狀病毒等冠狀病毒屬病毒均無交叉反應(yīng)。 試劑盒相關(guān)內(nèi)容已制定成團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn) “T/ CVMA 15-2020 新型冠狀病毒動物血清抗體雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測方法”,且生產(chǎn)單位參與了標(biāo)準(zhǔn)的制定,其檢測性能可靠。 不過抗體檢測也有其局限性,如抗體的產(chǎn)生依賴于動物的免疫狀態(tài),不適用于免疫缺陷動物的檢測;同時抗體的產(chǎn)生需要窗口期,在窗口期檢測會出現(xiàn)假陰性結(jié)果,因此后續(xù)的實(shí)驗(yàn)還需結(jié)合核酸檢測進(jìn)行研究。

本實(shí)驗(yàn)檢測的樣品既包含了常用品系動物,如KM、BALB / c 小鼠,SD、Wistar 大鼠等,也有各種模式動物,結(jié)果顯示新冠病毒抗體均為陰性。 推測可能的原因之一是這些種類的動物機(jī)體細(xì)胞無新冠病毒受體,因而對新冠病毒不易感。 由于新冠病毒的強(qiáng)致病性和感染性,操作活病毒需要生物安全3級以上實(shí)驗(yàn)室,目前還未有實(shí)驗(yàn)動物人工感染新冠病毒的報道;另一原因可能在于實(shí)驗(yàn)動物是一類特殊群體,飼養(yǎng)環(huán)境、微生物狀況、飼養(yǎng)人員、飼料和墊料等均嚴(yán)格控制,獲得感染的幾率很小,故新冠病毒抗體為陰性。

表1 實(shí)驗(yàn)動物樣本詳細(xì)信息Table 1 Information for laboratory animal samples

表2 實(shí)驗(yàn)動物血清中新冠病毒抗體ELISA 檢測結(jié)果Table 2 ELISA test results of anti-coronavirus antibody in serum of experimental animals