劉 艷,許 路,邵阿末,曾金艷,楊國青

(1.無錫衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校,江蘇 無錫 214028; 2.西安市中心醫(yī)院病理科,西安 710003)

膠質(zhì)瘤起源于腦神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,約占顱腦腫瘤的40% ～50%,該腫瘤彌漫浸潤生長、侵襲性強。 臨床上采取手術(shù)、放化療結(jié)合的方法治療,雖然取得一些進(jìn)展,但預(yù)后整體不理想,復(fù)發(fā)率高、生存期短。 微小RNA( microRNA,miRNA) 是一種小分子單鏈RNA,不具有編碼功能,長為20～25 個堿基, 序列高度保守。 研究表明miRNA的表達(dá)改變與多種腫瘤的進(jìn)程密切有關(guān),它們可能具有腫瘤激活和腫瘤抑制的功能[1-2]。 miR-186 在膠質(zhì)瘤中表達(dá)降低,功能實驗表明其具有抑癌作用[3]課題組前期研究表明miR-186 通過靶向調(diào)節(jié)Smad6 對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖有一定作用[4],但是否會影響到遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化尚不清楚,本研究對此進(jìn)行探討。

1 材料和方法

1.1 實驗細(xì)胞

人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 細(xì)胞株購自中國科學(xué)院北京細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素購自HyClone 公司;轉(zhuǎn)染 試 劑 LipofectamineTM2000、 TRIzol 購 自 美 國Invitrogen 公司;DNA 聚合酶、MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶和緩沖體系購自Promaga 公司;dNTP 及相關(guān)引物均由北京生工生物工程有限公司合成;凝膠配置相關(guān)產(chǎn)品購自北京碧云天生物技術(shù)研究所; 血清購自Biological Industries 公司; E-cadherin、 Vimentin、 βactin 等抗體購自美國Abcam 公司;PDTC 為Sigma公司產(chǎn)品;PVDF 膜、化學(xué)發(fā)光底物ECL 來自美國Millipore 公司;HF160W 型水套式二氧化碳培養(yǎng)箱購自上海力申科學(xué)儀器有限公司; BioPhotometer plus 核酸蛋白測定儀購自Eppendorf 公司;電泳設(shè)備購自美國BIO-RAD 公司; FR-200A 凝膠分析系統(tǒng)購自上海普諾森生物科技有限公司; Lighter Cycler2.0 實時熒光定量PCR 擴增儀購自Roche 公司;PE9600PCR 擴增儀購自PE 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251 用含10%胎牛血清、青-鏈霉素混合液的DMEM 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),放于5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng),每天觀察細(xì)胞生長情況,及時進(jìn)行換液。 選生長狀態(tài)良好的細(xì)胞作為實驗用細(xì)胞。

1.3.2 實驗分組和試劑轉(zhuǎn)染

細(xì)胞分組為對照組(U251)、模擬物組(miR-186 mimics)、質(zhì)粒組( pc-Smad6) 和共轉(zhuǎn)染組( miR-186 mimics + pc-Smad6 )。 根據(jù)說明書制備miR-186 mimics 或pc-Smad6 和Lipofectamine TM2000 脂質(zhì)體復(fù)合物。 實驗組加入miR-186 mimcs 和( 或) pc-Smad6 脂質(zhì)體復(fù)合物。

1.3.3 基因檢測(RT-qPCR)

收集細(xì)胞,TRIzol 裂解、提取總RNA。 測定各組的總RNA 濃度,然后取適量總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,最后取cDNA 模板于反應(yīng)體系中進(jìn)行RT-qPCR。miRNA-186 上 游 引 物 5′-GCCGCCAAAGAATTCT CCTTT-3, 下 游 引 物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3;Smad6 上游引物5′-CTGGAGTTGTTGAGCAGCC-3′,下游 引 物5′-GTGCGTCTTTCTTGTTTTGTCC-3′; βactin 上 游 引 物5′-CCCATGTTCGTCATGGGTGT-3′,下游引物5′-TGGTCATGAGTCCTTCCACGATA-3′擴增條件為94 ℃5 min,94 ℃30 s、56 ℃30 s、72 ℃40 s,共40 個循環(huán)。 重復(fù)3 次實驗,收集數(shù)據(jù),計算基因的相對表達(dá)量。

1.3.4 Western blot 檢測各組細(xì)胞的蛋白

胰酶消化并收集四組細(xì)胞,PBS 清洗細(xì)胞數(shù)次,然后RIPA 裂解液裂解細(xì)胞,取上清液,BCA 法測各組蛋白濃度,每組取10 μg 蛋白進(jìn)行SDS-PAGE 電泳,然后并將其轉(zhuǎn)移至PVDF 膜,用含有脫脂奶粉的TBST 封閉液封閉1 h,加入兔抗人多克隆抗體,4℃孵育過夜, TBST 洗膜3 遍,每次5 min,加入辣根過氧化物酶體HRP 標(biāo)記的二抗24℃孵育2 h,TBST避光洗膜3 遍,每次15 min。 最后加發(fā)光夜于儀器中曝光拍照,計算蛋白的相對表達(dá)量。

1.3.5 劃痕實驗

將接種至6 孔板中,待細(xì)胞匯合至85%左右時,有20 μL 槍頭劃痕,PBS 洗去脫落的細(xì)胞,顯微鏡觀察并拍照,24 h 后繼續(xù)觀察顯微鏡觀察細(xì)胞的遷移情況并拍照。 計算細(xì)胞遷移率以判斷細(xì)胞的遷移能力。 實驗均重復(fù)3 次。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-186 和Smad6 在正常星形膠質(zhì)細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 中的表達(dá)

如圖1 所示,RT-qPCR 和Western blot 實驗結(jié)果表明,與正常星形膠質(zhì)細(xì)胞相比,miR-186 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 中表達(dá)明顯降低,而Smad6 的基因和蛋白表達(dá)水平均顯著增高,兩者呈反相關(guān)系。 該結(jié)果提示在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 中miR-186 可能發(fā)揮抑癌作用,而Smad6 則發(fā)揮的是促癌作用。

圖1 RT-qPCR 和Western blot 檢測細(xì)胞中miR-186 和Smad6 的表達(dá)Note.A/ B, Statistical analysis of gene expression.C, Protein bands.D, Statistical analysis of protein expression.Compared with normal glial cells, ?P<0.05.Figure 1 RT-qPCR and Western blot detection of miR-186 and Smad6 expression in cells

2.2 轉(zhuǎn)染miR-186 mimics 和(或)pc-Smad6 后,各組U251 細(xì)胞中Smad6 的表達(dá)變化

如圖2 所示,本實驗的RT-qPCR 和Western blot結(jié)果表明,將miR-186 mimics 轉(zhuǎn)染入膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 后,Smad6 的表達(dá)顯著降低,而轉(zhuǎn)染Smad6 質(zhì)粒后,其表達(dá)水平明顯升高。 與Smad6 質(zhì)粒組相比,共轉(zhuǎn)染miR-186 mimics 和Smad6 質(zhì)粒組Smad6的表達(dá)顯著降低。 該結(jié)果說明miR-186 可負(fù)向調(diào)控Smad6 的表達(dá)。

2.3 miR-186 調(diào)控Smad6 對膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移的影響

圖3 遷移實驗顯示, 與空白組相比, miR-186 mimics 組U251 細(xì)胞的遷移率明顯降低, 而pc-Smad6 組的遷移率則顯著升高(P<0.05);與Smad6質(zhì)粒組相比,共轉(zhuǎn)染miR-186 mimics 和Smad6 質(zhì)粒組細(xì)胞遷移率顯著升高(P<0.05)。 上述結(jié)果表明,miR-186 能抑制U251 細(xì)胞遷移的作用,這種作用可被Smad6 過表達(dá)所逆轉(zhuǎn)。

2.4 miR-186 調(diào)控Smad6 對膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT 的影響

由圖4 可知,與對照組相比,miR-186 mimics 組上皮細(xì)胞黏附分子E-cadherin 的表達(dá)顯著升高,而間質(zhì)細(xì)胞黏附分子Vimentin 的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。 在pc-Smad6 組中兩種分子的表達(dá)情況相反(P< 0.05 )。 與pc-Smad6 組相比, miR-186 mimics + pc-Smad6 組Vimentin 的表達(dá)水平明顯降低,而E-cadherin 的表達(dá)水平顯著升高。 由此可見,miR-186 過表達(dá)可通過作用于Smad6 改變細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白E-cadherin 和Vimentin 的表達(dá)情況。

3 討論

膠質(zhì)瘤是起源于神經(jīng)外胚層的腫瘤,浸潤性生長、失控性增殖,惡性程度高,治療難度大、易復(fù)發(fā),其機制尚不明確[5-6]。 故從分子水平尋求治療靶點是目前膠質(zhì)瘤研究的重要方向之一。 miRNA 可通過調(diào)控某些重要基因的表達(dá)而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[7]。

圖2 RT-qPCR 和Western blot 檢測各組細(xì)胞中Smad6 的表達(dá)Note.A, Statistical analysis of gene expression.B, Protein bands.C, Statistical analysis of protein expression.Compared with the U251 group, ?P<0.05.Compared with the pc-Smad6 group,#P<0.05.Figure 2 RT-qPCR and Western blot detection of Smad6 expression in each group cells

圖3 劃痕實驗檢測各組細(xì)胞的遷移情況Note.A, The migration figure.B, Migration rate statistics.Compared with the U251 group, ?P < 0.05.Compared with the pc-Smad6 group.#P<0.05.Figure 3 Wound healing assay anylasis of cell migration

研究發(fā)現(xiàn)miR-186 在多種腫瘤中表達(dá)異常,某些報道表明該基因在個別腫瘤中高表達(dá),發(fā)揮促癌基因的功能[8-9]。 但更多的研究報道顯示miR-186在較多腫瘤中發(fā)揮的為抑癌基因的作用,其中miR-186 在胃癌中低表達(dá), 與該腫瘤的進(jìn)展與轉(zhuǎn)移有關(guān)[10]。 miR-186 在膽管癌和乳腺癌中低表達(dá),可通過靶向調(diào)節(jié)Twist1 的表達(dá)影響癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[11-12]。 Niinuma 等[13]的研究表明miR-186 的表達(dá)下調(diào)與胃腸道間質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)有關(guān)。 Ruan 等[14]研究表明miR-186 在肺癌中發(fā)揮抑癌作用,通過靶向SIRT6 抑制肺癌進(jìn)展。 另有研究表明該基因在膠質(zhì)瘤中也是低表達(dá),發(fā)揮抑癌功能,但是具體的機制并不明確[15]。

Smad6 基因位于15q21-22,屬于抑制性Smad蛋白,可調(diào)控TGF-β(Transformation growth factor-β)信號通路。 TGF-β 具有促進(jìn)血管生成、抑制免疫、和刺激細(xì)胞外基質(zhì)形成等作用,故有利于腫瘤生長、擴散和轉(zhuǎn)移[16]。 研究發(fā)現(xiàn)Smad6 在小細(xì)胞肺癌、肝癌中均存在表達(dá)增加的現(xiàn)象[17]。 本課題組前期研究表明Smad6 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中亦高表達(dá)。 其表達(dá)增加受miRNA-186 直接調(diào)控,并影響了腫瘤細(xì)胞的增殖[4]。 但是否會影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化尚不明確,本研究對此進(jìn)行證實。

圖4 Western blot 檢測各組細(xì)胞中Smad6 的表達(dá)Note.A, Protein bands.B / C, Statistical analysis of protein expression.Compared with the U251 group, ?P<0.05.Compared with the pc-Smad6 group, #P<0.05.Figure 4 Western blot detection of Smad6 expression in each group cells

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是指上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變,該變化可引起腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯增加[18-19],從而促進(jìn)了惡性腫瘤的浸潤生長和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,降低了患者的生存質(zhì)量甚至危及生命。 在上皮間質(zhì)發(fā)生過程中,上皮細(xì)胞標(biāo)志分子E-cadherin 等表達(dá)下降, 而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子Vimentin、 Ncadherin 等的表達(dá)明顯增加。 研究表明miRNA 可通過調(diào)控某些基因而影響惡性腫瘤的遷移和侵襲。如王小明等[20]研究表明miR-206 通過調(diào)節(jié)VEGFA對人肝癌細(xì)胞的侵襲和遷移具有抑制作用。 亦有研究表明miR-186 可調(diào)節(jié)靶基因而影響惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生[11-12]。

本研究結(jié)果再次證實了在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中,miR-186 低表達(dá),而Smad6 高表達(dá),兩者呈反向關(guān)系。 通過實驗進(jìn)一步驗證了miR-186 過表達(dá)后,膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力降低,E-cadherin 表達(dá)降低,Vimentin 的表達(dá)升高, Smad6 的表達(dá)降低; 轉(zhuǎn)染Smad6 質(zhì)粒后, 膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力增強, Ecadherin 表達(dá)升高,而Vimentin 的表達(dá)降低;與轉(zhuǎn)染質(zhì)粒Smad6 組比,共轉(zhuǎn)染miR-186 模擬物和質(zhì)粒Smad6 組膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力降低,E-cadherin表達(dá)降低,Vimentin 的表達(dá)升高,Smad6 的表達(dá)亦降低。 故該結(jié)果表明miR-186 可通過調(diào)節(jié)Smad6 抑制細(xì)胞遷移,減弱上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白Vimentin 表達(dá),增加E-cadherin 蛋白表達(dá)。 但miR-186 是否會結(jié)合其他靶基因共同調(diào)控膠質(zhì)瘤的遷移與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化目前尚不清楚,需要我們進(jìn)一步的研究。