劉佳楠 馬曌磊 蘇榮健 黃克強

1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院暨口腔醫(yī)學(xué)院，錦州 121004；2.錦州醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院，錦州 121000

頭頸部癌癥是全球第八大常見癌癥?？谇击[狀細(xì)胞癌在口腔癌中發(fā)病率最高，其中發(fā)生在舌部最為多見。2018年，全世界約有345 900例口腔癌新病例，17.74萬人死于口腔癌[1]，且近年來，發(fā)病年齡趨向年輕化[2]。以手術(shù)為主的綜合序列治療是舌癌的主要治療方法，但由于舌癌惡性程度較高，且易發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移，普通的化療藥物有時難以取得令人滿意的治療效果[3]。因此，探索針對舌鱗狀細(xì)胞癌的新型治療藥物具有重要意義。

果蠅zeste基因增強子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）是多梳蛋白復(fù)合體家族的主要成員之一。研究[4-5]顯示，在多種腫瘤組織中均可出現(xiàn)EZH2高表達(dá)現(xiàn)象。EZH2參與調(diào)節(jié)組蛋白H3第27位賴氨酸（H3K27）甲基化，在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和基因沉默中發(fā)揮著重要的作用。GSK126作為一種高度選擇性EZH2抑制劑[6]，已被證實在前列腺癌、肺癌、乳腺癌等多種癌癥中具有治療效果[7]，但目前在舌癌方面的研究不多。本文旨在觀察GSK126對舌鱗癌CAL-27細(xì)胞增殖與凋亡的影響，并初步探討其相關(guān)機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株CAL-27（中國生命科學(xué)院提供），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國），GSK126（Sel-leck公司，美國），Hoechst33342試劑（北京索萊寶科技有限公司），5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2’-deoxyuridine，EdU）試劑盒（廣州銳博生物科技有限公司），JC-1試劑盒（上海愛必信生物科技有限公司），二辛可酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）抗體、磷酸化的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（phospho-extracellular regulated protein ki-nases，p-ERK）抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體、Cleaved caspase-9抗體、β actin抗體（CST公司，美國），電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）試劑（沈陽萬類生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 使用含10%FBS和1%雙抗（青霉素/鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基，將人舌癌CAL-27細(xì)胞置于5%CO2，37 ℃恒溫環(huán)境下培養(yǎng)。細(xì)胞傳代時使用胰蛋白酶消化貼壁細(xì)胞，DMEM終止消化并離心，重懸后接種于培養(yǎng)皿中。

1.2.2 藥物干預(yù) 將GSK126用二甲基亞砜（dimethyl

sulfoxide，DMSO）溶解后放置于-80 ℃保存，實驗時各給藥組按照不同濃度對儲存液進(jìn)行稀釋，溶劑對照組加入相同體積的DMSO。

1.2.3 甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）實驗 取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，消化離心后將細(xì)胞密度調(diào)整為每孔5×103個，均勻鋪于96孔板中。設(shè)置5個復(fù)孔，邊緣孔使用無菌PBS補充。細(xì)胞貼壁后加入濃度梯度的GSK126（1、2.5、5、10、15 μmol·L-1），空白對照組不加藥（0 μmol·L-1），溶劑對照組加入相同體積的DMSO，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后向每孔加入20 μL MTT溶液，孵育3 h后吸棄上清，加入150 μL DMSO，低速震蕩使結(jié)晶充分溶解。最后用酶標(biāo)儀測定各孔在490 nm處的光密度（optical density，OD）值，計算細(xì)胞存活率=（實驗組OD值/空白對照組OD值）×100%。

1.2.4 克隆形成實驗 將對數(shù)生長期的CAL-27細(xì)胞消化，離心，重懸后接種于六孔板中，細(xì)胞密度設(shè)為每孔1 000個。待細(xì)胞貼壁且生長良好時按不同的濃度（5、10 μmol·L-1）給予藥物處理，對照組加入同等體積的DMSO，繼續(xù)培養(yǎng)10 d后吸棄上清，使用4%多聚甲醛室溫固定30 min，再加入結(jié)晶紫染色，20 min后用PBS洗滌2次，拍照記錄實驗結(jié)果并計算每孔中的細(xì)胞群落數(shù)，克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.2.5 EdU增殖成像檢測 將對數(shù)生長期的CAL-27細(xì)胞以細(xì)胞密度為每孔3×104個接種于3個共聚焦皿中，培養(yǎng)至正常生長階段，藥物處理濃度分別為5、10 μmol·L-1，對照組用等體積DMSO進(jìn)行處理，培養(yǎng)48 h后更換細(xì)胞培養(yǎng)液為含EdU的培養(yǎng)基，孵育2 h，吸棄培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛進(jìn)行細(xì)胞固定化處理，用2 mg·mL-1甘氨酸脫色，加入滲透劑（0.5%Triton-100）后行Apollo染色，避光室溫下?lián)u床孵育30 min，用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-pheny-lindole，DAPI）染料染核，使用共聚焦顯微鏡拍照并記錄每個視野內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)目。細(xì)胞增殖率=（EdU陽性細(xì)胞數(shù)/DAPI陽性細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.2.6 Hoechst33342染色 實驗收集處于對數(shù)生長期的CAL-27細(xì)胞并按照細(xì)胞密度為每孔5×104個均勻接種于3個小培養(yǎng)皿內(nèi)，細(xì)胞貼壁且生長良好時分別加入濃度梯度為5、10 μmol·L-1的GSK126，并設(shè)置DMSO溶劑對照組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，向每個培養(yǎng)皿中加入Hoechst33342工作液充分覆蓋細(xì)胞，37 ℃恒溫孵箱內(nèi)孵育20 min，置于熒光顯微鏡下觀察，拍照并記錄實驗結(jié)果。

1.2.7 JC-1染色實驗 將CAL-27細(xì)胞按照細(xì)胞密度為每孔3×104個均勻接種在3個共聚焦皿中，細(xì)胞貼壁后分別加入5、10 μmol·L-1的GSK126，溶劑對照組不加藥，培養(yǎng)48 h后吸去培養(yǎng)液，PBS洗滌1次，加入1 mL培養(yǎng)液及配置好的JC-1工作液，充分混勻，37 ℃孵育20 min，孵育結(jié)束后吸除上清，用JC-1染色緩沖液洗滌2次，加入培養(yǎng)液并放置于共聚焦顯微鏡下觀察紅/綠熒光比例，拍照記錄實驗結(jié)果。

1.2.8 Western blot實驗 收集經(jīng)不同濃度GSK126處理后的舌癌細(xì)胞，加入蛋白裂解液置于冰上充分裂解，離心后取上清使用BCA蛋白定量法定量，測定蛋白濃度并制樣。配置凝膠進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfate polyacry lamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）電泳，聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜轉(zhuǎn)膜，5%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封閉2 h后，分別加入ERK、p-ERK、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-9兔抗人一抗及β actin鼠抗人一抗，4 ℃過夜，TBST洗膜3次后加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h后再次洗膜，ECL顯色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組細(xì)胞存活率、增殖率及克隆形成率均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組之間比較使用單因素方差分析，兩兩比較使用t檢驗，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GSK126可抑制CAL-27細(xì)胞增殖

MTT實驗結(jié)果表明，隨著GSK126藥物濃度變化（0、1、2.5、5、10、15 μmol·L-1），細(xì)胞存活率分別為100.00%±0.00%、88.13%±4.16%、83.76%±4.16%、53.73%±2.21%、31.47%±2.76%、13.11%±0.85%，細(xì)胞存活率隨著藥物濃度增加而持續(xù)下降（圖1）。與DMSO組相比，GSK126對CAL-27細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，且呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

圖 1 MTT法檢測不同濃度GSK126對CAL-27細(xì)胞增殖的影響Fig 1 MTT assay was used to detect the effects of GSK126 with different concentrations on CAL-27 cell proliferation

與DMSO組相比，隨著GSK126濃度增加，克隆形成的群落數(shù)逐漸減少，其中DMSO組、5 μmol·L-1組的克隆形成率分別為55.20%±3.91%、26.30%±2.91%。10 μmol·L-1組中肉眼未見有明顯的克隆群落形成（圖2）。方差分析結(jié)果顯示，GSK126組和DMSO組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=244.794，P=0.000）。

圖 2 GSK126對CAL-27細(xì)胞克隆形成能力的影響Fig 2 Effect of GSK126 on the colony formation ability of CAL-27 cells

EdU增殖成像檢測結(jié)果見圖3。由圖3可見，經(jīng)5、10 μmol·L-1GSK126處理后，CAL-27細(xì)胞的陽性比例明顯較DMSO組降低，且呈濃度依賴性。DMSO組、5 μmol·L-1、10 μmol·L-1組增殖率分別為88.88%±7.87%、30.30%±10.02%、11.25%±13.15%。經(jīng)方差分析，3組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=58.582，P=0.000）。

2.2 GSK126可促進(jìn)CAL-27細(xì)胞凋亡

Hoechst33342染色后，DMSO組細(xì)胞形態(tài)正常，呈均勻淡染藍(lán)色，核膜形態(tài)完整；5 μmol·L-1組見部分CAL-27細(xì)胞形態(tài)大小不均，出現(xiàn)碎片化，細(xì)胞核呈高亮狀態(tài)；10 μmol·L-1組見細(xì)胞熒光強度更高，細(xì)胞核固縮、破碎更明顯，大部分細(xì)胞形態(tài)變小且不規(guī)則，破裂成碎片狀，死細(xì)胞明顯增多（圖4）。

圖 3 EdU熒光染色實驗檢測細(xì)胞增殖能力 共聚焦顯微鏡Fig 3 Proliferation ability of cells was detected by EdU fluorescence staining confocal microscope

圖 4 Hoechst33342染色檢測CAL-27細(xì)胞凋亡情況 倒置熒光顯微鏡 × 40Fig 4 Apoptosis of CAL 27 cells was detected by Hoechst33342 staining inverted fluorescence microscope × 40

JC-1熒光探針檢測結(jié)果見圖5。DMSO組細(xì)胞活性良好，線粒體膜電位較高，JC-1聚集在線粒體基質(zhì)中產(chǎn)生紅色熒光；經(jīng)不同濃度（5、10 μmol·L-1）的GSK126處理后，JC-1不能聚集在線粒體基質(zhì)中，而是以單體形式存在，呈現(xiàn)出綠色熒光，提示線粒體膜電位較低，細(xì)胞可能正在發(fā)生早期凋亡。

2.3 GSK126影響CAL-27細(xì)胞增殖、凋亡的機制分析

Western blot檢測結(jié)果見圖6和表1。與對照組相比，GSK126作用后的CAL-27細(xì)胞內(nèi)，ERK的表達(dá)水平無顯著性變化（P>0.05），p-ERK表達(dá)水平呈降低趨勢。Bax、Cleaved caspase-9表達(dá)水平升高，Bcl-2的表達(dá)水平降低，各條帶呈現(xiàn)近似濃度依賴性。經(jīng)方差分析，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

3 討論

舌鱗狀細(xì)胞癌是口腔鱗狀細(xì)胞癌中最具侵襲性的一種[8]。盡管在過去的30年里，各種治療方法都取得了進(jìn)步，但舌鱗狀細(xì)胞癌患者的總體5年生存率仍不及50%[9]。化療是舌癌的治療方法之一，近年來，隨著化療技術(shù)的發(fā)展及新型化療藥物的問世，人們對于舌癌治療藥物的探索也逐步深入。

圖 5 JC-1熒光探針檢測CAL-27細(xì)胞凋亡情況 共聚焦顯微鏡Fig 5 Apoptosis of CAL 27 cells detected by JC 1 fluorescent probe confocal microscope

圖 6 Western blot檢測p-ERK、ERK、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-9蛋白表達(dá)Fig 6 Expressions of p-ERK, ERK, Bax, Bcl-2, Cleaved caspase-9 detected by Western blot

研究[10-11]表明，EZH2是多梳抑制復(fù)合物PRC2（po lycomb repressive complex 2）的核心亞基，它可特異性催化組蛋白H3上第27位賴氨酸（H3K27）的甲基化，在表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的作用，目前已被證實EZH2與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程相關(guān)。GSK126是一種以EZH2為靶點的新型競爭性抑制劑[12]，其作為一種新型抗癌藥物，已處于臨床試驗階段[13]。本實驗通過MTT、克隆形成、EdU熒光染色、Hoechst33342熒光染色、JC-1染色、Western blot等一系列的實驗方法表明，GSK126可以有效抑制人舌癌CAL-27細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，且呈濃度依賴性。

在克隆形成及EdU染色實驗中可見，GSK126作用于舌癌CAL-27細(xì)胞后，細(xì)胞增殖水平明顯下降。研究發(fā)現(xiàn)，MEK/ERK通路與腫瘤細(xì)胞增殖過程密切相關(guān)，此通路能通過層層級聯(lián)反應(yīng)將細(xì)胞外刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi)[14-15]，已經(jīng)證實在舌鱗癌細(xì)胞中存在MEK/ERK過度激活現(xiàn)象[16]，因此抑制ERK信號的激活與傳導(dǎo)對于抗腫瘤研究具有重要意義。Western blot實驗結(jié)果證實，GSK126抑制了p-ERK的表達(dá)水平，使進(jìn)入活化狀態(tài)的ERK減少，這可能與CAL-27細(xì)胞增殖率下降有關(guān)。

表 1 不同濃度GSK126下各蛋白的相對表達(dá)水平Tab 1 Relative expression levels of each protein at different concentrations of GSK126

細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過程[17]，受到多種相關(guān)因子的共同調(diào)控，線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是其中一條途徑。Bax和Bcl-2是參與調(diào)控細(xì)胞凋亡的一組基因，Bax過表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而Bcl-2具有抑制凋亡作用。研究發(fā)現(xiàn)，正常情況下，細(xì)胞內(nèi)部的Bax與Bcl-2比例固定，當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡信號時，Bax/Bcl-2比值增大，使線粒體膜通透性升高，細(xì)胞色素C（CytC）得以釋放[18-19]，進(jìn)而激活下游Caspase-9，Caspase-3等相關(guān)凋亡蛋白，產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)[20]。而當(dāng)Bcl-2含量增多時，它可與Bax形成異源二聚體，阻礙Bax發(fā)揮促凋亡作用[21]。本研究Western blot結(jié)果顯示，隨著GSK126濃度升高，Bax含量升高而Bcl-2含量下降，Bax/Bcl-2比值增大，而Cleaved caspase-9也呈現(xiàn)上升趨勢，表明經(jīng)GSK126處理后，激活了Bax/Bcl-2通路，從而誘導(dǎo)更多的細(xì)胞進(jìn)入了凋亡階段。

綜上所述，GSK126作為一種新型EZH2抑制劑，可抑制舌鱗狀細(xì)胞癌CAL-27細(xì)胞的增殖并且促進(jìn)其凋亡，其機制可能與MEK/ERK通路以及Bax/Bcl-2通路有關(guān)，提示GSK126可能成為一種具有前景的新型舌癌治療藥物。然而，舌癌的侵襲與發(fā)展過程復(fù)雜，GSK126對于舌癌的抑制效果是否還與其他機制有關(guān)仍有待進(jìn)一步研究。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。