付漢斌 羅琳

湖北省武漢市武昌醫(yī)院口腔科，武漢 430063

唾液腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic car-cinoma，SACC）作為唾液腺高發(fā)惡性腫瘤，具有較強的侵襲力，可沿神經或血循環(huán)發(fā)生遠處轉移，特別是易發(fā)生肺轉移，患者總體預后不佳，死亡率較高。研究[1]表明，高復發(fā)和轉移特性是導致患者死亡的主要因素。目前，對SACC復發(fā)及轉移相關機制尚未完全清楚。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）作為一類長度在200個核苷酸以上的內源性RNA，不具有編碼蛋白能力或僅能編碼小分子多肽，但近年來研究發(fā)現(xiàn)，其參與了多種腫瘤發(fā)生、進展及侵襲轉移過程，且與惡性腫瘤患者預后密切相關。

HOX反義基因間RNA（HOX transcript antisense intergenic RNA，HOTAIR）作為重要的lncRNA類型，參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生及進展過程，且有許多研究指出，HOTAIR在口腔鱗狀細胞癌組織中呈高表達。本研究分析SACC組織中HOTAIR表達，探討其與患者臨床病理指標以及預后的相關性，以期為SACC機制研究及預后判斷提供臨床資料。

1 材料和方法

1.1 一般資料

選取2007年3月至2014年3月在武漢市武昌醫(yī)院口腔科行手術切除治療的SACC患者86例為研究對象，其中男性37例，女性49例，年齡23～74歲，平均年齡（53.04±12.23）歲。納入標準：1）術前未行放化療治療，術后經病理學檢查確診；2）臨床資料完整且完成院外隨訪。腫瘤部位：小唾液腺39例，大唾液腺47例。病理學類型：實體型25例，管狀型29例，篩孔型32例。按照TNM分期標準：Ⅰ～Ⅱ期38例，Ⅲ～Ⅳ期48例；發(fā)生神經侵犯43例，出現(xiàn)淋巴結轉移31例。手術過程中取SACC組織，置于凍存管中，-80 ℃保存。

同期選取因唾液腺良性腫瘤行手術治療患者45例作為對照，留取距離腫瘤邊緣>2 cm正常唾液腺組織，其中男性20例，女性25例，平均年齡（54.15±11.97）歲，與SACC患者在性別、年齡無差異（P>0.05）。本研究通過武漢市武昌醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者均行知情同意。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測HOTAIR表達水平 取SACC組織和正常唾液腺組織，剪碎后研磨，按總RNA提取試劑盒（上海市閃晶分子生物科技有限公司）用Trizol法提取總RNA，使用分光光度計（日立公司，日本）檢測總RNA純度，OD260/OD280在1.80～2.20為純度高。使用逆轉錄試劑盒（大連市寶生物工程有限公司）對總RNA進行逆轉錄，獲得互補DNA（complementary DNA，cDNA）。按照PCR擴增試劑盒（大連市寶生物工程有限公司）說明用7500型實時熒光定量PCR儀（ABI公司，美國）對引物進行擴增，引物序列由上海英駿生物技術有限公司設計合成。引物序列：HOTAIR上游5’-GGGTGGCT-CACTCTTCTGGC-3’，下游5’-TGGCCTTGCCCGG-GCTTGTC-3’；β肌動蛋白上游5’-GACCTCTATG-CC AACACAGT-3’，下游5’-AGTACTTGCGCTCA-GGAGGA-3’。PCR條件：95 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 35 s，74 ℃ 30 s，循環(huán)40次。使用2 ΔΔCt法計算SACC組織和正常唾液腺組織中的HOTAIR表達水平，2 ΔΔCt表示為SACC組織較正常唾液腺組織中基因的相對表達倍數，ΔCt=Ct（目的）-Ct（內參）；ΔΔCt=ΔCt（SACC組織） ΔCt（正常唾液腺組織）。

1.2.2 病例隨訪 SACC患者于術后隨訪，隨訪形式包括門診復查、電話、住院病歷查閱等，隨訪截止日期為2019年3月31日，以死亡作為終點事件，記錄患者死亡情況及生存時間。

1.3 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析，計量資料采用均數±標準差表示，SACC患者腫瘤組織和因唾液腺良性腫瘤行手術治療患者的正常唾液腺組織間HOTAIR表達量比較采用獨立樣本t檢驗，不同病理學類型的SACC組織中HOTAIR表達量比較采用單因素方差分析；以SACC患者組織中HOTAIR相對表達量的四分位數為標準，將患者分為低表達組和高表達組，采用Kaplan-Meier法和Log-Rank檢驗對兩組生存時間進行比較；以年齡、性別、腫瘤部位、病理學類型、腫瘤直徑、TNM分期、神經侵犯和淋巴結轉移為自變量，采用Cox比例風險回歸模型對影響預后的多因素進行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HOTAIR在SACC組織和正常唾液腺組織中表達水平比較

實時熒光定量PCR結果顯示，SACC組織中HOTAIR相對表達量為2.48±0.22，高于正常唾液腺組織的1.03±0.13，差異有統(tǒng)計學意義（t=39.812，P<0.001）。

2.2 HOTAIR在不同臨床病理指標的SACC患者組織中表達水平比較

不同年齡、性別、部位、病理學類型和直徑的SACC組織中HOTAIR相對表達量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；與TNM分期Ⅰ～Ⅱ期、未發(fā)生神經侵犯及淋巴結轉移患者相比，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、發(fā)生神經侵犯及淋巴結轉移SACC患者組織中HOTAIR相對表達量升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

2.3 HOTAIR表達水平對SACC患者生存時間的影響

截止2019年3月31日，86例患者中46例患者死亡，隨訪時間9～144個月，中位隨訪時間51.5個月。以SACC患者組織中HOTAIR相對表達量的四分位數為標準，分為低表達組（n=22）和高表達組（n=64例）。Kaplan-Meier生存分析結果顯示，低表達組患者平均生存時間（113.32±10.77）個月，累積生存率72.73%，高表達組患者平均生存時間（59.75±6.50）個月，累積生存率39.06%；Log-Rank檢驗示，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=8.242，P=0.004），見圖1。

2.4 影響SACC患者預后的多因素分析

Cox比例風險回歸模型分析結果顯示，神經侵犯、淋巴結轉移和HOTAIR高表達是影響SACC患者預后的獨立風險因素（HR=3.274、2.971、2.911，P<0.05），見表2。

3 討論

SACC作為中老年人群的高發(fā)惡性腫瘤，發(fā)生及進展機制較為復雜，目前尚未完全清楚。隨著臨床上根治性手術切除聯(lián)合放化療的應用，SACC患者生存率得到提高，但由于腫瘤侵襲力強，且具有嗜神經生長的特性，治療后易發(fā)生復發(fā)及轉移，嚴重影響了患者生存質量及生存時間。因此，深入探討SACC發(fā)生進展機制以及與侵襲轉移相關的敏感基因或生物標志物，對患者早期診療及改善預后具有重要意義。

表 1 不同臨床病理指標SACC組織中HOTAIR相對表達量的比較Tab 1 Comparison on the relative expression levels of HOTAIR in SACC tissues with different clinico pathological indexes

圖 1 HOTAIR表達水平對SACC患者生存時間的影響的Kaplan-Meier分析圖Fig 1 Kaplan-Meier analysis chart of the effect of HOTAIR expres -sion level on survival time of SACC patients

表 2 影響SACC患者預后的多因素Cox比例風險回歸模型分析Tab 2 Analysis on multiple factors influencing the prognosis of patients with SACC by using Cox proportional hazards regression

lncRNA作為近年來的研究熱點，其在腫瘤發(fā)生、進展及惡性生物學特性中的作用越來越受到重視，有研究[2-3]指出，頭頸部惡性腫瘤組織中出現(xiàn)多種lncRNA表達異常。lncRNA異常表達與頸部惡性腫瘤細胞惡性增殖、遷移及侵襲密切相關。

HOTAIR作為一種lncRNA，下調其表達可抑制三陰性乳腺癌細胞的增殖，增強其表達則可促進細胞增殖抑制凋亡，從而促進多發(fā)性骨髓瘤對地塞米松的化學耐藥性。亦有研究[4]指出，HOTAIR可促進鼻咽癌的侵襲和遷移。本研究結果顯示，SACC組織中HOTAIR相對表達量高于正常唾液腺組織，說明HOTAIR在SACC組織中呈高表達，可能參與了SACC發(fā)生過程。本研究結果顯示，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、發(fā)生神經侵犯及淋巴結轉移SACC患者組織中HOTAIR相對表達量升高，說明HOTAIR高表達可能參與了SACC惡性進展及侵襲轉移過程。這些結果提示HOTAIR可能通過影響SACC細胞侵襲轉移能力而參與了SACC發(fā)生及進展過程。

有研究指出，HOTAIR可作為腫瘤疾病患者的預后循環(huán)標志物。Da等[5]指出，HOTAIR的高表達水平與胃癌患者較差的生存期有關，可能是胃癌潛在獨立預后生物標志物。本研究結果顯示，低表達組患者平均生存時間和累積生存率均高于高表達組，說明HOTAIR表達與SACC患者生存時間和生存率有關， HOTAIR低表達患者有更長的生存時間和更高的生存率。本研究Cox比例風險回歸模型分析結果顯示，HOTAIR表達是影響SACC患者預后的獨立風險因素，進一步說明HOTAIR表達與患者預后有關，是影響患者預后的風險因素，提示HOTAIR可能是SACC潛在的預后生物學指標。

綜上所述，HOTAIR在SACC患者組織中呈高表達，與腫瘤惡性化進展及患者不良預后有關，有望成為SACC患者預后評估的潛在標志物。但鑒于本研究樣本量有限，且是單中心研究，尚需進一步開展多中心、大樣本的隊列研究予以確證。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。