高振鵬 孟掉琴 王 瑜 吳 霞 任耀鵬 岳田利

(1.西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院， 陜西楊凌 712100； 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質量安全風險評估實驗室(楊凌)， 陜西楊凌 712100)

0 引言

蘋果濁汁經(jīng)益生菌發(fā)酵后被賦予新的風味，同時可以通過代謝產(chǎn)生抑菌物質，延長蘋果濁汁的貨架期[1-3]。但是由于含有活的益生菌，在存放期間益生菌繼續(xù)增殖及后酸化，使蘋果濁汁的品質受到一定影響。要確保蘋果濁汁穩(wěn)定、不褐變、口感好及活菌菌體濃度高，需要準確預測益生菌發(fā)酵蘋果濁汁的貨架期。

食品在貯藏過程中各項指標的變化是控制產(chǎn)品質量的重要因素，這些指標影響食品的貨架期。食品貨架期指食品理化性質、微生物、風味、感官等品質指標保持最優(yōu)的時間長度[4-5]。近年來，動力學模型被廣泛應用于食品貨架期模型的研究中，Arrhenius方程是描述食品貨架期指標變化反應速率常數(shù)與溫度的方程，通常被用來構建一些預測模型，以進行食品貨架期的預測[3]。目前，研究者利用動力學模型建立了濕米線、酸奶及雙胞蘑菇等產(chǎn)品貨架期的預測模型[6-8]。

目前，尚未見有關益生菌發(fā)酵蘋果濁汁產(chǎn)品貨架期預測模型的研究報道。本文探究不同貯藏溫度下益生菌發(fā)酵蘋果濁汁各項基礎理化指標及香氣成分的變化，為獲得貨架期長、營養(yǎng)成分高的發(fā)酵蘋果濁汁提供理論依據(jù)，同時，構建益生菌發(fā)酵蘋果濁汁貨架期預測模型，為發(fā)酵蘋果濁汁的貯藏和銷售提供一定的技術支持和理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長富、秦冠蘋果，均購自陜西省楊凌示范區(qū)市場；嗜酸乳桿菌 6005(Lactobacillusacidophilus)、植物乳桿菌21805(Lactobacillusplants)、發(fā)酵乳桿菌 21828(Lactobacillusfermentum)，均保存于西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院健康食品制造與安全控制實驗室。

MRS培養(yǎng)基，北京陸橋技術股份有限公司；蘋果酸、乳酸、檸檬酸、丙酮酸、琥珀酸、酒石酸，分析純，純度98%以上，上海源葉生物科技有限公司；蔗糖、果糖、葡萄糖，色譜純，上海源葉生物科技有限公司；2-辛醇，GC標準品，日本東京化成工業(yè)株式會社。

1.2 儀器與設備

2000JP-1型離心果汁機，南通金橙機械有限公司；WMC-9005A/T型5 L發(fā)酵罐，上海萬木春生物工程有限公司；UV-1240型紫外/可見分光光度儀，日本島津公司；Ci7600型色度儀，愛色麗(上海)色彩科技有限公司；LC-15C型液相色譜儀，日本島津公司；TRACE1310-ISQLT型氣相色譜質譜聯(lián)用儀，賽默飛爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1蘋果濁汁的制備

在文獻[9]制備蘋果濁汁工藝的基礎上進行2 500 r/min離心、20 MPa均質處理，增加濁汁的穩(wěn)定性。

1.3.2發(fā)酵培養(yǎng)條件

將種子液(嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌體積比1∶1∶1)[9]按10%接種量接種于裝有2 L蘋果濁汁的發(fā)酵罐中，發(fā)酵溫度為37℃、發(fā)酵時間24 h，不補料。

1.3.3指標測定方法

發(fā)酵結束后將發(fā)酵果汁分裝于100 mL玻璃瓶，分別置于4℃和25℃下避光貯存，貯藏的樣品每隔7 d取樣，測定各項品質指標，使用SPSS 20.0進行數(shù)據(jù)分析。

(1)品質指標測定

活菌菌體濃度測定采用傾注平板法[10](GB 4789.35—2016)；感官評定采用9點快感標度法[11]。

穩(wěn)定系數(shù)的測定：在4 200 r/min下蘋果濁汁被離心15 min，660 nm下測定離心后上層液體和離心前果汁的吸光度。采用穩(wěn)定系數(shù)對果汁穩(wěn)定性進行表征，穩(wěn)定系數(shù)為660 nm下果汁離心后與離心前的吸光度比值[12]，這個比值越大，說明離心后果汁中的懸浮物沉降得越少，果汁越穩(wěn)定。

色澤穩(wěn)定性的測定采用色差儀法：使用色差儀對儀器背景校準后，測定L*、a*、b*，用ΔE表示總色差，表征果汁顏色的變化，計算公式[13]為

(1)

式中L*——待測樣明暗度(黑白值)

a*——待測樣紅綠值

b*——待測樣黃藍值

(2)有機酸含量測定

將發(fā)酵蘋果濁汁離心取上清液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾上樣，對蘋果汁中的7種有機酸進行定量分析[14]。

色譜條件：Waters x Terra MS C18型色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：A相為100%甲醇，B相為0.01 mol/L (NH4)3PO4(pH值為2.7)；梯度洗脫條件：0～8 min，A相60%；8～15 min，A相100%；樣品進樣量10 μL；樣品流速0.7 mL/min；柱溫30℃。

檢測器：紫外檢測器(DAD)，檢測波長210 nm。

(3)糖含量測定

將發(fā)酵蘋果濁汁離心后取上清液，0.45 μm濾膜過濾后上樣，對發(fā)酵蘋果濁汁中的葡萄糖、果糖、蔗糖含量進行定量分析[15]。

色譜條件：色譜柱為Sugar-Pak TM I(Waters)及保護柱；流動相：85%乙腈；樣品進樣量20 μL，流速0.6 mL/min，柱溫80℃；檢測器：示差折光檢測器，檢測池溫度35℃。

(4)香氣成分測定

采用頂空固相微萃取(Head-space solidphase micro-extraction, HS-SPME)進行香氣成分的富集，使用氣相色譜-質譜(Gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)上機測定。在文獻[16]色譜條件基礎上改進。將5 mL樣品置于20 mL進樣瓶中，分別加入1.5 g的NaCl和一定量的內(nèi)標溶液(2-辛醇)，上機測定。樣品在45℃下平衡30 min，經(jīng)老化的萃取頭頂空吸附30 min，然后進行解析。

色譜條件：DB-5MS型毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；進樣口溫度250℃，載氣為He，流速為1.93 mL/min，不分流進樣。程序升溫，初始溫度40℃，保持3 min后以3℃/min的速度升溫至120℃，再以4℃/min的速度升溫至160℃，再以6℃/min的速度升溫至240℃，保持8 min。

質譜條件：離子源溫度為230℃，接口溫度為230℃，離子化方式EI，發(fā)射能量70 eV，質量掃描范圍35～500(質荷比)。

采集到的質譜圖與NIST14 library和Wiley library庫中的數(shù)據(jù)匹配，保留匹配度大于85%的物質，使用內(nèi)標的濃度乘以揮發(fā)物的峰面積與內(nèi)標峰面積的比率來計算香氣成分化合物的含量[17]。

1.4 貨架期模型建立及驗證

1.4.1品質變化反應速率常數(shù)確定

利用Excel對試驗中各項指標隨貯存時間變化的數(shù)據(jù)進行擬合，根據(jù)反應方程，求出對應的零級和一級反應速率常數(shù)k，根據(jù)決定系數(shù)R2，選擇合適的動力學模型[5,18-20]。

1.4.2反應活化能確定

根據(jù)Arrhenius方程[21]，方程兩邊取對數(shù)，作lnk與1/T之間的關系曲線(T表示貯存溫度)，由直線的截距和斜率確定常數(shù)A和活化能Ea，公式為

(2)

式中R——氣體常數(shù)，8.314 J/(mol·K)

1.4.3品質指標預測模型的建立及驗證

根據(jù)擬合結果，選擇不同的模型方程，零級反應模型方程為

y=y0-kt

(3)

式中y——品質指標測試值

y0——品質指標初始測試值

t——貯存時間，d

一級反應模型方程為

lny=lny0+kt

(4)

結合Arrhenius方程，推導出品質指標預測模型，零級動力學預測模型為

(5)

一級動力學預測模型為

(6)

通過計算模型相對誤差、偏差度Bf和準確度Af對模型擬合度進行評價[22]。

1.4.4貨架期預測模型的建立

將活菌菌體濃度動力學預測模型變形，得到貨架期與活菌菌體濃度的關系方程，即不同貯存溫度下的貨架期預測模型[23]，方程表達式為

(7)

式中S——貨架期，d

Ft——貨架期結束時品質指標測試值

2 結果與討論

2.1 不同溫度貯存過程中各項指標的變化

2.1.1活菌菌體濃度

不同貯存溫度下色差變化值ΔE、穩(wěn)定系數(shù)、活菌菌體濃度及感官評分變化如表1所示。

由表1可知，4℃貯存條件下各項指標均有顯著差異，色差變化值ΔE在貯存期間逐漸增加，穩(wěn)定系數(shù)降低，活菌菌體濃度和感官評分也隨著貯存時間延長而呈下降趨勢。

貯存過程中發(fā)酵蘋果濁汁ΔE一直在增加，當ΔE≥2時，果汁顏色發(fā)生肉眼可見的變化。在4℃、28 d和25℃、21 d時，ΔE大于2，此時發(fā)酵蘋果濁汁顏色發(fā)生了明顯改變。這與文獻[24]的紅肉蘋果濁汁冷藏條件下色澤的變化趨勢相一致。此外，4℃條件下穩(wěn)定系數(shù)下降趨勢較小，28 d時穩(wěn)定系數(shù)達0.26，變化明顯比25℃時小，說明溫度對穩(wěn)定系數(shù)的影響顯著(p<0.05)。

表1 不同貯存溫度下品質指標Tab.1 Quality indicators at different storage temperatures

25℃、28 d的貯存條件下，發(fā)酵蘋果濁汁中活菌菌體濃度仍能達到7.80×107CFU/mL，遠高于輕工行業(yè)標準規(guī)定的大于105CFU/mL的標準。隨著發(fā)酵結束，發(fā)酵蘋果濁汁中乳酸菌已進入衰亡期，乳酸菌細胞壁處于低pH值環(huán)境，需要更多的能量來維持細胞內(nèi)的pH值，導致ATP減少，從而乳酸菌因細胞壁破壞而死亡，活菌菌體濃度下降[25]。感官評分是產(chǎn)品貯存期的關鍵指標，得分高低直接影響其外觀品質和口感接受度[26-27]，由表1可知，發(fā)酵蘋果濁汁感官評分值不斷下降，且貯藏溫度越高，下降越快。0～7 d期間，溫度對發(fā)酵蘋果濁汁的感官評分無顯著影響(p>0.05)，7 d后25℃條件下感官評分下降較快。低溫減緩了發(fā)酵蘋果濁汁的褐變，避免了一些不良反應的發(fā)生，4℃、28 d發(fā)酵蘋果濁汁發(fā)酵氣息變濃，蘋果果香味變淡，較大程度突出了果汁發(fā)酵的良好口感和色澤。

2.1.2香氣成分

對4℃和25℃貯存條件下發(fā)酵蘋果濁汁的香氣成分進行檢測，經(jīng)質譜分析圖譜比對分析后，相似度大于85%的共29種香氣成分，其中醇類6種，酯類9種，醛酮類6種，酸類3種，其他類5種。研究貯存期間發(fā)酵蘋果濁汁香氣成分的變化，繪制不同溫度下香氣物質總質量濃度柱狀圖，如圖1所示。

由圖1可知，在0～14 d，發(fā)酵蘋果濁汁中醇類和酸類物質總質量濃度在增加，14～28 d期間下降；總酯和總醛酮質量濃度隨著貯存時間增加而減少，4℃時下降程度小于25℃，可能由于25℃溫度過高，造成香氣物質逸散，從而質量濃度降低，其他類物質總質量濃度變化不顯著。因此，發(fā)酵蘋果濁汁在低溫下貯藏，既能保持蘋果濁汁鮮爽的風味，減少香氣逸散，保留大部分香氣成分，又能通過低溫降低果汁發(fā)酵產(chǎn)生的輕微澀感和刺喉感，使風味更為柔和。

2.1.3有機酸、糖質量濃度

結合上述結果，本試驗測定了4℃條件下發(fā)酵蘋果濁汁貯存期間的有機酸、糖質量濃度變化，結果如表2所示。

由表2可知，4℃貯存期間發(fā)酵蘋果濁汁中葡萄糖及果糖含量增加，蔗糖含量下降。4℃條件下，0～21 d期間發(fā)酵蘋果濁汁中草酸質量濃度從0.33 mg/mL增加到0.39 mg/mL，21 d后不再增加；丙酮酸含量先下降后上升；0～14 d期間乙酸含量增加，14～28 d期間乙酸含量不變。0～7 d期間蘋果酸含量下降，主要是乳酸菌在發(fā)酵過程中利用蘋果酸進行三羧酸循環(huán)等生化反應，產(chǎn)生其他酸[28]，從而導致蘋果酸含量降低。貯存期間由于乳酸菌的生長消耗糖類物質，產(chǎn)生有機酸，導致有機酸總量增加。

2.2 品質指標預測模型的建立及驗證

2.2.1品質指標預測模型的建立

對L*、a*、b*、ΔE、穩(wěn)定系數(shù)、活菌菌體濃度和感官評分隨貯存時間變化的數(shù)據(jù)進行擬合，得到擬合曲線，求出相應的零級和一級反應速率常數(shù)k及決定系數(shù)R2，結果如表3所示。

由表3可知，b*零級動力學模型的決定系數(shù)大于一級動力學模型，L*、a*、活菌菌體濃度、穩(wěn)定系數(shù)和感官評分一級動力學模型的決定系數(shù)大于零級動力學模型，因此b*和ΔE選用零級動力學模型，其他指標選用一級動力學模型。

結合Arrhenius方程，作lnk與1/(1 000T)之間的關系曲線，如圖2所示。

根據(jù)曲線斜率和截距計算得到L*、a*、b*、ΔE、穩(wěn)定系數(shù)、活菌菌體濃度、感官評分的活化能Ea分別為1.49×105、1.87×104、1.84×104、1.65×104、1.19×104、2.05×104、7.9×103J/mol，A分別為1.26×106、111.85、1 525.22、563.52、24.77、2 518.45、2.89。

圖1 不同溫度貯存下香氣物質總質量濃度Fig.1 Histogram of total concentration change of aroma species at different storage temperatures

表2 4℃下貯存期間有機酸、糖質量濃度變化Tab.2 Changes in organic acid and sugar content during storage at 4℃

表3 理化品質在不同貯存溫度下的動力學模型參數(shù)Tab.3 Parameters of kinetic models of quality at different storage temperatures

將Ea和A代入式(5)和式(6)中，得到各品質指標預測模型。

L*預測模型方程

(8)

a*預測模型方程

(9)

b*預測模型方程

(10)

ΔE預測模型方程

(11)

穩(wěn)定系數(shù)Q預測模型方程

(12)

活菌菌體濃度V預測模型方程

(13)

感官評分W預測模型方程

(14)

2.2.2品質指標預測模型驗證

利用各品質指標預測模型方程計算驗證組的L*、a*、b*、ΔE、活菌菌體濃度、穩(wěn)定系數(shù)和感官評分預測值，與實測值以1∶1繪制二者相關性曲線。對模型預測值和實測值的相對誤差、偏差度和準確度進行計算，結果如表4所示。

由表4可知，各品質指標預測值與實測值的二者相關性曲線決定系數(shù)R2均較高，說明預測值與實測值極相關。建立的各品質指標預測模型相對誤差均在10%以內(nèi)，偏差度和準確度均不大于1.04，均在可接受范圍內(nèi)，表明所建模型能夠快速準確預測4℃與25℃貯藏條件下發(fā)酵蘋果濁汁的L*、a*、b*、活菌菌體濃度、穩(wěn)定系數(shù)和感官評分。

圖2 4℃與25℃條件下不同品質指標的Arrhenius曲線Fig.2 Arrhenius curves of different quality indicators at 4℃ and 25℃

表4 不同品質指標預測模型的預測值與實測值Tab.4 Predicted and measured values of different quality indicators prediction models

2.2.3貨架期預測模型的建立與驗證

活菌是發(fā)酵制品的重要觀測指標，活菌數(shù)量決定產(chǎn)品的壽命長短，也決定其營養(yǎng)價值，因此以活菌作為發(fā)酵蘋果濁汁貨架期預測指標，使用SPSS 20.0分析活菌與其他品質指標的相關性，用皮爾遜相關系數(shù)表示，結果如表5所示。

表5 活菌菌體濃度與其他指標的皮爾遜相關系數(shù)Tab.5 Person correlation coefficient among various indicators and viable counts

由表5可知，發(fā)酵蘋果濁汁中活菌與其他指標均顯著相關，其中與a*和ΔE顯著負相關，說明活菌可以作為發(fā)酵蘋果濁汁的貨架期模型預測指標。

根據(jù)活菌動力學預測模型，得到發(fā)酵蘋果濁汁貨架期與活菌的關系方程

(15)

式中Vt——貨架期結束時活菌菌體濃度

對獲得的發(fā)酵蘋果濁汁貨架期模型進行驗證，根據(jù)模型方程計算4℃和25℃下活菌菌體濃度的貨架期預測值，然后與實測值進行比較，如表6所示。

表6 不同溫度下發(fā)酵蘋果濁汁的貨架期預測值與實測值Tab.6 Predicted and observed shelf life of cloudy apple juice at different storage temperatures

由表6可知，在4、25℃條件下發(fā)酵蘋果濁汁貨架期預測值與實測值相對誤差分別為3.49%和2.98%，均小于10%，說明建立的發(fā)酵蘋果濁汁活菌菌體濃度貨架期預測模型可以很好地預測發(fā)酵蘋果濁汁在4～25℃的貨架期。

3 結論

(1)在4℃和25℃貯存條件下，貯存28 d后發(fā)酵蘋果濁汁的色澤和穩(wěn)定系數(shù)下降，活菌菌體濃度仍能達到7.80×107CFU/mL，遠高于輕工行業(yè)標準；在發(fā)酵蘋果濁汁貯存過程中，共檢測到29種香氣成分，其中醇類6種、酯類9種、醛酮類6種、酸類3種，其他類5種；貯存期間，酯類總量降低，醛酮總量降低，酸類含量先增加、后減少。

(2)基于Arrhenius方程，建立了發(fā)酵蘋果濁汁L*、a*、b*、ΔE、穩(wěn)定系數(shù)、活菌菌體濃度和感官評分的預測模型方程。經(jīng)驗證，發(fā)酵蘋果濁汁模型預測值與實測值相對誤差均小于10%，偏差度和準確度不大于1.04，說明模型可以很好地預測發(fā)酵蘋果濁汁貯存期的L*、a*、b*、ΔE、活菌菌體濃度、穩(wěn)定系數(shù)和感官評分等指標。

(3)在發(fā)酵蘋果濁汁貯藏過程中，活菌菌體濃度與其他品質指標均呈顯著相關，以其建立的4、25℃條件下的發(fā)酵蘋果濁汁貨架期模型預測值與實測值的相對誤差小于10%，說明模型可靠、合理，可以準確預測發(fā)酵蘋果濁汁的貨架期。