鄭 巍，郭良君*，金永生

(1.陸軍第七十二集團(tuán)軍醫(yī)院藥劑科，浙江湖州 313000；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院有機(jī)化學(xué)教研室，上海 200433)

近年來，隨著深部真菌感染的逐年增多，抗真菌藥物的頻繁應(yīng)用，真菌耐藥問題日益凸顯。白念珠菌(Candidaalbicans)是最常見的致病菌，氟康唑(fluconazole)是臨床上首選的抗白念珠菌感染藥物，但是長(zhǎng)期和重復(fù)給藥導(dǎo)致白念珠菌對(duì)氟康唑耐藥越來越嚴(yán)重[1-2]。為應(yīng)對(duì)日益加劇的真菌耐藥，從植物源性藥物中發(fā)掘與抗真菌藥物具有協(xié)同增效作用的小分子化合物是近年來的研究方向之一[3]。油松葉為松科植物油松PinustabulaeformisCarr.的針狀葉，主產(chǎn)于吉林南部、遼寧、河北、河南、山東、山西、內(nèi)蒙古等地[4]?！吨兴幋筠o典》中記載：“松葉味苦，溫。有祛風(fēng)燥濕，殺蟲，止癢之功用。民間用松毛煎湯治療濕癢、頑癬”[5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究也表明，油松葉提取物具有抗炎、鎮(zhèn)痛、改善心肌缺血及抑菌等多種活性。油松葉的抗真菌作用研究顯示，其揮發(fā)油、乙醇提取物具有較強(qiáng)的真菌抑制作用[6-9]。但對(duì)油松葉的協(xié)同抗真菌作用未見報(bào)道。因此，本文以油松葉為研究對(duì)象，采用醇提后再用石油醚萃取的方法得到低極性部位，通過測(cè)定油松葉低極性部位聯(lián)合氟康唑?qū)δ退幇啄钪榫淖钚∫志鷿舛?MIC80)值，探究其對(duì)氟康唑的增效活性，同時(shí)采用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法對(duì)低極性部位的化學(xué)成分進(jìn)行分析鑒定，深入探討油松葉的協(xié)同抗真菌成分。

1 材 料

1.1 儀器和菌株 Thermo Trace GC Ultra氣相色譜及Thermo DSQ Ⅱ質(zhì)譜(美國賽默飛世爾公司)。氟康唑耐藥的白念珠菌103(MIC80>128.0 μg/ml)由海軍軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院真菌室贈(zèng)送。

1.2 藥品和試劑 油松葉于2018年采集自浙江省東陽市，經(jīng)海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室黃寶康教授鑒定為油松PinustabulaeformisCarr.的新鮮枝葉。氟康唑注射液(批號(hào)B348806，輝瑞制藥公司)；黃芩素(純度≥98%，批號(hào)2022563，上海歷鼎生物技術(shù)有限公司)；二甲亞砜(DMSO，中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)； 所有試劑均為市售分析純，水為重蒸水，載氣為高純氦氣。

2 方 法

2.1 油松葉低極性部位的制備 取干燥油松葉，粉碎，稱取2份，每份10.0 g，分別用50 ml石油醚和80%乙醇加熱回流提取1 h，過濾；濾渣再分別用50 ml石油醚和80%乙醇加熱回流提取1 h，過濾。合并兩次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，回收溶劑，得石油醚提取物(PE)0.57 g和80%乙醇提取物(ET)2.18 g。取干燥后的ET 1.0 g，加入水50 ml混溶，將所得混懸液用20 ml石油醚萃取3次，合并濃縮石油醚萃取液，得石油醚浸膏即油松葉低極性部位(ET-PE)0.28 g。取125 mg ET-PE浸膏，置于100 ml量瓶中，加入80%甲醇，超聲、加熱使其幾近完全溶解，放置，冷卻；再加入80%甲醇定容，搖勻，放置；吸取1 ml定容后的浸膏液，微孔濾膜(孔徑 0.45 μm)過濾后待測(cè)。

2.2 藥敏試驗(yàn) 采用美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standard Institute,CLSI)提出的RPMI 1640 培養(yǎng)基微量稀釋法，取無菌96孔板，于每排1號(hào)孔加RPMI 1640液體培養(yǎng)基100 μl作為空白對(duì)照；3～12號(hào)孔各加新鮮配制的白念珠菌103菌液100 μl，菌液濃度范圍為(1～5)×103cfu/ml；2號(hào)孔分別加菌液160 μl和受試藥物溶液40 μl，使藥物終濃度為250.0 μg/ml；2～11號(hào)孔分別加入倍比稀釋后的藥物，使各孔的最終藥物濃度分別為125.0、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49和0.245 μg/ml；12號(hào)孔不含藥物，只加菌液100 μl作陽性生長(zhǎng)對(duì)照。各孔中DMSO含量均<1%，氟康唑溶液的終濃度為8.0 μg/ml。96孔板于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后取出，讀取受試藥物與氟康唑(8.0 μg/ml)聯(lián)用時(shí)的MIC80值。協(xié)同藥效的判定采用聯(lián)合抑菌濃度分?jǐn)?shù)指數(shù)(FICI)，即聯(lián)用抑菌時(shí)每種藥物所需MIC80與單用這種藥物抑菌時(shí)所需MIC80的比值的和。當(dāng)FICI≤0.5時(shí)，兩種藥物的相互作用效果被定義為具有協(xié)同作用；當(dāng)FICI>0.5時(shí)，認(rèn)為兩種藥物無相互作用。

2.3 色譜和質(zhì)譜條件 色譜柱為TR-35MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，程序升溫，起始溫度40 ℃，保持 2 min后以10 ℃/min的速度升至300 ℃并保持5 min；汽化溫度250 ℃，進(jìn)樣量1 μl；分流比10∶1。載氣是高純氦氣，流速1.0 ml/min。離子源：EI源；離子源溫度為250 ℃；電子能量：70 eV；m/z掃描范圍：50～650。

3 結(jié) 果

3.1 油松葉提取物聯(lián)合氟康唑的藥敏試驗(yàn)結(jié)果 如表1所示，各受試藥物單用時(shí)，對(duì)照品黃芩素(BE)的 MIC80為 15.63 μg/ml，提示其具有一定的抗菌活性，其他化合物的MIC80均>250 μg/ml。各受試藥物與氟康唑(8.0 μg/ml)聯(lián)用后，對(duì)照品BE、油松葉80%乙醇提取物(ET)及油松葉低極性部位(ET-PE)的MIC80降至1.95 ～ 3.91 μg/ml，其FICI均<0.5，顯示BE、ET、ET-PE與氟康唑聯(lián)用對(duì)耐藥白念珠菌具有協(xié)同抗菌作用。PE單用及與氟康唑聯(lián)用的MIC80均>250 μg/ml，F(xiàn)ICI>0.5，顯示其沒有協(xié)同氟康唑抗耐藥白念珠菌的作用。

表1 油松葉3種提取物與氟康唑聯(lián)用體外抗白念珠菌103活性的80%最小抑菌濃度(MIC80)Table 1 The 80% minimal inhibitory cencontrations(MIC80) of three extracts from Pinus tabulaeformis Carr.leaves combined with fluconazole against Candida albicans 103 in vitro

3.2 油松葉低極性部位的化學(xué)成分 按照2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣后5 min，得到油松葉低極性化學(xué)成分的總離子流圖(見圖1)。共檢測(cè)出30個(gè)峰，通過檢索NIST08光譜數(shù)據(jù)庫，按60%以上匹配率(SI和RSI均>600，最大值1000)，并結(jié)合質(zhì)譜裂解規(guī)律確定其化學(xué)成分。采用峰面積歸一法通過Xcalibur化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，測(cè)得各個(gè)化學(xué)成分在油松葉低極性部位中的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。

本研究共檢測(cè)并鑒定出 30個(gè)化合物， 見表2。

圖1 油松葉低極性化學(xué)成分的總離子流譜圖Figure 1 Total ion chromatogram of low polarity components from Pinus tabulaeformis Carr.leaves

表2 油松葉低極性化學(xué)成分的GC-MS法分析結(jié)果Table 2 Analysis results of low polarity components of Pinus tabulaeformis Carr.leaves by GC-MS method

(續(xù)表2)

本次所測(cè)油松葉的低極性化學(xué)成分中含有脂肪酸(酯、醇)5個(gè)(11.16%)，甾烷類6個(gè)(18.69%)，倍半萜9個(gè)(30.62%)，二萜8個(gè)(35.17%)，其中含量較高的兩個(gè)主要化學(xué)成分是15-羥基脫氫樅酸甲酯(含量11.73%，見圖2)和脫氫樅酸甲酯(含量7.67%，見圖3)。

圖2 15-羥基脫氫樅酸甲酯和化合物29的質(zhì)譜比較Figure 2 Comparison of the mass spectra of 15-hydroxydehydroabietic acid,methyl ester and compound 29A：15-羥基脫氫樅酸甲酯；B：化合物29

圖3 脫氫樅酸甲酯和化合物22的質(zhì)譜比較Figure 3 Comparison of the mass spectra of methyl dehydroabietate and compound 22A:脫氫樅酸甲酯;B:化合物22

4 討 論

白念珠菌是引起皮膚黏膜和系統(tǒng)性真菌感染的常見病原菌。臨床可用的抗真菌藥物種類有限，主要包括唑類、棘白菌素類和多烯類抗菌藥物。氟康唑是臨床使用最廣泛的抗生素之一，但由于濫用和長(zhǎng)期治療等原因?qū)е履退巻栴}日益嚴(yán)重[10]。目前，從植物中篩選出一些自身抗真菌活性較弱或無抗真菌活性，但能對(duì)抗真菌藥物有協(xié)同作用的化學(xué)成分并與之聯(lián)合使用是一個(gè)重要的研究方向。油松葉提取物作為一種天然的植物成分，資源豐富，有抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛等多種藥理活性，但有關(guān)其抗真菌作用的報(bào)道很少，未見抗耐藥白念珠菌作用的報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)油松葉的PE和ET單用時(shí)均無抗耐藥白念珠菌活性，但與氟康唑(8 μg/ml)聯(lián)用后，ET表現(xiàn)出抗耐藥白念珠菌活性，而PE依然沒有活性。繼續(xù)對(duì)ET進(jìn)行分段萃取，獲得油松葉低極性部位(ET-PE)，協(xié)同實(shí)驗(yàn)顯示其單用時(shí)也沒有抗耐藥白念珠菌活性，但聯(lián)用氟康唑(8 μg/ml)后，表現(xiàn)出協(xié)同作用。這表明ET和ET-PE是有效的氟康唑抗真菌增效劑。乙醇屬于親水性有機(jī)溶劑，對(duì)各類化學(xué)成分的溶解度都較好，提取成分較石油醚提取更全面，因此ET的氟康唑增效作用可能源于其比PE具有更豐富、含量更高的化學(xué)成分。ET-PE進(jìn)一步富集了ET的低極性化學(xué)物質(zhì)，依然具有氟康唑增效作用，這些低極性化學(xué)物質(zhì)可能包含了一些重要的活性抗真菌成分。進(jìn)一步對(duì)活性部位ET-PE進(jìn)行GC-MS化學(xué)成分分析，結(jié)果顯示其化學(xué)成分主要為以石竹烯、樅酸甲酯為代表的倍半萜及二萜類物質(zhì)。而文獻(xiàn)報(bào)道油松葉揮發(fā)油的主要化合物是以蒎烯、茨烯和石竹烯為主的單萜、倍半萜及其含氧化合物。藥理研究結(jié)果顯示，蒎烯具有抗真菌作用，對(duì)白念珠菌有明顯的抑菌和殺菌作用[11]。與文獻(xiàn)比較，本研究所獲得的低極性成分缺少了油松葉揮發(fā)油中以蒎烯為主的單萜類成分，但分子量更大的倍半萜(30.62%)、二萜(35.17%)類化學(xué)成分含量升高。蒎烯等單萜類成分的缺失可能是ET-PE單用對(duì)耐藥白念株菌無抗菌作用的原因之一。ET-PE中的倍半萜類成分含量最高的是石竹烯及其氧化物(6.36%)。文獻(xiàn)報(bào)道石竹烯及其氧化物對(duì)紅色毛癬菌、須毛癬菌等具有顯著的抗真菌活性[12]。ET-PE中含量最高的二萜類成分是脫氫樅酸甲酯(19.4%)，這也是松香酸的主要成分[13]。文獻(xiàn)報(bào)道松香酸對(duì)赤霉菌、灰霉菌等具有抗真菌活性[14-15]。因此，ET-PE中的倍半萜和二萜類化合物可能是其協(xié)同氟康唑抗耐藥白念珠菌作用的重要活性成分，值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究首次報(bào)道了油松葉ET以及ET-PE具有協(xié)同氟康唑抗耐藥白念珠菌作用，可以作為聯(lián)合用藥的候選藥物來解決氟康唑的耐藥問題，且來源豐富，具有較好的開發(fā)前景，但其協(xié)同氟康唑抗耐藥白念株菌的作用機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。另外，本研究首次對(duì)油松葉ET-PE進(jìn)行了GC-MS分析，鑒別的化合物中β-石竹烯、?-木羅烯、(-)-桉油烯醇、氧化石竹素、τ-木羅醇、α-畢橙茄醇、α-愈創(chuàng)木烯、西松烯、浙麥角醇等倍半萜類成分與油松葉揮發(fā)油成分有重合，而環(huán)氧異香樹烯、1,5,5,8-四甲基雙環(huán)[4.2.1]壬)-乙酸、植物醇、脫氫樅酸甲酯與油松幼枝、松果揮發(fā)油的GC-MS分析結(jié)果有重合，其他化合物均為首次從該植物中發(fā)現(xiàn)，豐富了油松葉的化學(xué)成分[16-20]。