張以宏

(泉州市畜牧站，福建 泉州 362000)

蜜蜂是保護(hù)生態(tài)系統(tǒng)良性循環(huán)的重要環(huán)節(jié)，在維持生物多樣性方面有重要的價(jià)值和意義，能有效促進(jìn)農(nóng)牧業(yè)增產(chǎn)增值，并且還提供人類豐富、健康的蜜蜂產(chǎn)品[1-4].中華蜜蜂(Apiscerana)是我國蜜蜂屬最重要的種之一，是我國寶貴的本土遺傳資源，長期與我國當(dāng)?shù)氐沫h(huán)境適應(yīng)，形成了善于利用零星蜜粉源、低溫條件下采集、抗螨等優(yōu)良性狀[5].由于人類現(xiàn)代工業(yè)、農(nóng)業(yè)的活動和農(nóng)村環(huán)境的變化，蜜蜂生存環(huán)境破碎化.西方蜜蜂的引進(jìn)和大量飼養(yǎng)，加劇了我國珍貴的本土中華蜜蜂蜂種資源面臨的嚴(yán)重危機(jī).

福建省位于中國東南沿海，山地丘陵面積約占全省土地總面積的90%，森林覆蓋率居全國首位(62.96%)[6].福建省在自然條件下蘊(yùn)涵了豐富的中華蜜蜂資源，存在大量的野生蜂群，是中華蜜蜂模式標(biāo)本的采集地.同時(shí)，中華蜜蜂還是福建最主要的飼養(yǎng)蜂種，大約2/3的飼養(yǎng)蜂群為中華蜜蜂[7].對福建省的中華蜜蜂種群已從形態(tài)和分子角度分別進(jìn)行了研究.在形態(tài)遺傳標(biāo)記分析中，3個(gè)團(tuán)隊(duì)分別用3、5、30個(gè)形態(tài)標(biāo)記研究福建的中華蜜蜂遺傳分化.20世紀(jì)80年代，許少玉和楊冠煌根據(jù)吻長、翅長和肘脈指數(shù)研究了福州、永泰和南靖的中華蜜蜂[8].國家資源委員會通根據(jù)吻長、前翅長、前翅寬、肘脈指數(shù)、3+4腹節(jié)背板總長的5個(gè)指標(biāo)，及其它生物學(xué)特征將福建的中華蜜蜂歸為華南中蜂[9].周冰峰教授團(tuán)隊(duì)根據(jù)西方蜜蜂的形態(tài)測量標(biāo)記，測定了福建省除了泉州外的6個(gè)市的中華蜜蜂，發(fā)現(xiàn)各樣點(diǎn)間有明顯的形態(tài)差異[10].隨后，又通過5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記和線粒體非編碼區(qū)研究福建省的中華蜜蜂，發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星多樣性水平處于中度多樣性，線粒體遺傳多樣性水平較低[11-12].但是文獻(xiàn)中未見對泉州中華蜜蜂遺傳資源的研究.

泉州位于福建省東南沿海，是福建省經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)且自然條件優(yōu)越的地級市.境內(nèi)山巒起伏，丘陵、河谷、盆地錯落其間.地跨中南兩個(gè)亞熱帶，有短期干旱的亞熱帶雨林帶，常年雨量充沛，水資源相當(dāng)豐富.日照時(shí)間長，光熱資源豐富，造就了泉州豐富的蜜粉源植物資源.泉州主要蜜粉源植物有荔枝、龍眼、烏桕、枇杷、柃木、八葉五加等，這些豐富的蜜粉源植物非常適合中華蜜蜂生產(chǎn).全市中華蜜蜂飼養(yǎng)量達(dá)52 784群，泉州所轄區(qū)市縣均有飼養(yǎng).據(jù)2019年的統(tǒng)計(jì)，鯉城、豐澤、洛江、泉港四個(gè)區(qū)4 650群，晉江市1 318群，南安市23 620群，惠安縣3 875群，安溪縣4 475群，永春縣12 783群，德化縣8 700群，蜂群數(shù)量占泉州飼養(yǎng)蜂群總數(shù)的88.8%.在中華蜜蜂遺傳資源研究中，未見對泉州中華蜜蜂遺傳資源的報(bào)道.本研究采用形態(tài)、微衛(wèi)星和線粒體3種標(biāo)記，對福建泉州的7個(gè)縣市的樣點(diǎn)進(jìn)行全面的遺傳分化、遺傳特征和遺傳多樣性分析，探究泉州中華蜜蜂資源的特點(diǎn)，為保護(hù)和利用泉州本土的中華蜜蜂遺傳資源提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 樣本采集

中華蜜蜂樣本采自泉州市7個(gè)樣點(diǎn)，共487群，其中安溪(FJAX)63 群，德化(FJDH)88群，晉江(FJJJ)68群，永春(FJYC)72群，泉港(FJQG)62群，惠安(FJHA)63群，南安(FJNA)71群.為減少形態(tài)分析受樣本發(fā)育的影響，在天氣溫和、蜜粉源豐富的4月下旬有利于中華蜜蜂良好發(fā)育的環(huán)境下，樣本采集自正常蜂群.采集后樣本用無水乙醇處理，并放置于-80 ℃的超低溫冰箱保存?zhèn)溆?以遼寧省本溪市桓仁縣(BXHR)的中華蜜蜂作為外群對照.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 形態(tài)標(biāo)記測定 依據(jù)Ruttner[13]和楊冠煌[5]使用的蜜蜂形態(tài)遺傳標(biāo)記方法，共測定33個(gè)適合中華蜜蜂的形態(tài)遺傳標(biāo)記[14-15].包括與個(gè)體大小相關(guān)的吻長、第三背板長、第四背板長、第五背板長、第四腹板長、第四腹板蠟鏡長、蠟鏡斜長、蠟鏡間距、第七腹板長、第七腹板寬、股節(jié)長、脛節(jié)長、基跗節(jié)長、基跗節(jié)寬，與翅相關(guān)的右前翅翅長、右前翅翅寬、肘脈指數(shù)、肘脈a、肘脈b、后翅鉤數(shù)和11個(gè)翅脈角A4、B4、D7、E9、G18、J10、J16、K19、L13、N23、O26，與毛相關(guān)的第五背板絨毛帶長、第六背板毛長.

將帶JVC圖像采集器(TK-C921EC)的變倍體視顯微鏡(GL-99T1)與電腦形態(tài)測量系統(tǒng)(Image-Pro Express)聯(lián)用，對每個(gè)樣點(diǎn)的60只蜜蜂樣本進(jìn)行拍照，并對每個(gè)樣本的33個(gè)形態(tài)標(biāo)記進(jìn)行測量，獲得形態(tài)數(shù)據(jù).

1.2.2 基因組DNA提取與擴(kuò)增 每群蜜蜂樣本取1只工蜂提取全基因組，并分別進(jìn)行微衛(wèi)星標(biāo)記和線粒體標(biāo)記的擴(kuò)增.

微衛(wèi)星標(biāo)記利用ExTaq Hot Start Version擴(kuò)增試劑盒(寶生生物工程有限公司，大連)進(jìn)行38個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記擴(kuò)增試驗(yàn)，引物序列、PCR的擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序參考文獻(xiàn)[16-17]. 成功擴(kuò)增出目的條帶的樣品送至北京金唯智公司(GENEWIZ)進(jìn)行基因分型.

線粒體標(biāo)記采用蜜蜂屬特有的tRNAleu～COII序列進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列、PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序[18].PCR產(chǎn)物為352 bp序列，測序由上海英駿(Invitrogen)生物技術(shù)有限公司完成，測序儀為ABI PRISM 3730xl.本試驗(yàn)得到的序列用Clustal X軟件進(jìn)行序列比對，并與測序圖核對校準(zhǔn). 有變異的個(gè)體，進(jìn)行重復(fù)測序，驗(yàn)證其準(zhǔn)確性.

1.3 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

形態(tài)數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0軟件和STATISTICA 10軟件進(jìn)行分析. 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行逐步判別分析、聚類分析和ANOVA分析.采用STATISTICA 10軟件，進(jìn)行主成分分析，將33個(gè)標(biāo)記通過線性變換，提煉出少數(shù)幾個(gè)能充分反應(yīng)差異信息的標(biāo)記，并利用SPSS 20.0軟件構(gòu)建主成分散點(diǎn)圖和聚類樹.

微衛(wèi)星數(shù)據(jù)分析用Genepop在線分析樣點(diǎn)間的遺傳分化系數(shù)[19].采用Poptree 2構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Structure軟件進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析[20-22].Excel Micro-Satellite Toolkit 3.1[23]計(jì)算期望雜合度(He)、觀察雜合度(Ho)、平均多態(tài)信息含量(PIC).對線粒體數(shù)據(jù)采用DnaSP 5.0計(jì)算各樣點(diǎn)的平均核苷酸差異數(shù)(K)，核苷酸多樣度(Pi)和單倍型多樣度(Hd)[24].

2 結(jié)果與分析

2.1 泉州中華蜜蜂遺傳分化

根據(jù)各樣點(diǎn)中華蜜蜂的形態(tài)分化分析、微衛(wèi)星遺傳分化分析和線粒體分化分析的結(jié)果，未發(fā)現(xiàn)泉州中華蜜蜂發(fā)生種群遺傳分化.

泉州樣點(diǎn)的形態(tài)標(biāo)記主成分分析中的前2個(gè)主成分貢獻(xiàn)率占65.9%.其中主成分1貢獻(xiàn)率為47.31%，貢獻(xiàn)率高的形態(tài)標(biāo)記包括吻長、肘脈指數(shù)、第三背板長、第四背板長、第五背板長、第五背板絨毛帶長、第六背板絨毛長、第四腹板長、蠟鏡長、蠟鏡斜長、蠟鏡間距離、第四腹板長、蠟鏡長、蠟鏡間距離、第七腹板寬、翅脈角J10、肘脈a、肘脈b.主成分2貢獻(xiàn)率為18.62%，其中貢獻(xiàn)率高的形態(tài)標(biāo)記包括第五背板絨毛帶長、第七腹板長、基跗節(jié)長、翅脈角B4、D7、L3.在主成分1和2的主成分散點(diǎn)圖中，主成分1可明顯將泉州樣點(diǎn)和外群分開(圖1A).前4個(gè)主成分對變異解釋的貢獻(xiàn)率占87.1%，以此4個(gè)主成分進(jìn)行聚類分析，泉州7個(gè)樣點(diǎn)聚為一支(圖1B).形態(tài)數(shù)據(jù)的判別散點(diǎn)分析結(jié)果與主成分分析結(jié)果相似，同樣顯示泉州所有樣點(diǎn)遠(yuǎn)離外群聚為一組(圖1C).將解釋變異率達(dá)86.7%的前3個(gè)判別函數(shù)的重心函數(shù)進(jìn)行聚類，泉州7個(gè)樣點(diǎn)聚為一支(圖1D).

微衛(wèi)星標(biāo)記分析表明，泉州各中華蜜蜂樣點(diǎn)之間的遺傳分化系數(shù)(Fst)在0.03～0.10之間，但與外群BXHR樣點(diǎn)的Fst值在0.17～0.25之間.泉州各樣點(diǎn)的基因流Nm值在4.5～18.7之間.以遺傳分化系數(shù)(Fst)構(gòu)建的UPGMA聚類樹(圖2A)和N-J聚類樹(圖2B)中，所有泉州樣點(diǎn)在聚類樹的內(nèi)層聚為一支.遺傳結(jié)構(gòu)Structure分析中，根據(jù)形態(tài)分化結(jié)果預(yù)先設(shè)置分組K=2，結(jié)構(gòu)圖顯示泉州中華蜜蜂遺傳結(jié)構(gòu)相似，與外群的遺傳結(jié)構(gòu)有顯著差異(圖3).

2.2 泉州中華蜜蜂的特征

泉州7個(gè)樣點(diǎn)的中華蜜蜂的主要形態(tài)標(biāo)記特征相似.在測定的標(biāo)記中，有27個(gè)標(biāo)記無顯著差異，或差異較小.其中翅寬、肘脈指數(shù)、后翅鉤數(shù)、第七腹板寬這4個(gè)標(biāo)記無顯著差異.吻長、第五背板長、第五背板絨毛帶長和脛節(jié)長在樣點(diǎn)間的差異較大(P<0.01)，但未發(fā)現(xiàn)與樣點(diǎn)分布相關(guān)(表1).

泉州中華蜜蜂的線粒體tRNAleu～COII片段共檢測到28種單倍型，其中9種為新發(fā)現(xiàn)單倍型(表2).泉州7個(gè)樣點(diǎn)均以Acmt01001為主要單倍型，該單倍型在各樣點(diǎn)總樣本量的比例為50%～88%.單倍型Acmt01016在3個(gè)樣點(diǎn)檢測到，在晉江樣點(diǎn)和南安樣點(diǎn)占比較大，分別占樣本量的24%和15%.單倍型Acmt01002為4個(gè)樣點(diǎn)共有，在德化樣點(diǎn)檢測到較多樣本，占比18%.單倍型Acmt01030為4個(gè)樣點(diǎn)共有，在安溪樣點(diǎn)檢測到較多樣本，占比17%. 其余25種單倍型的檢測頻率較小，其中15種僅在1個(gè)樣點(diǎn)檢測到(表2).

表2 泉州中華蜜蜂單倍型分布1)

2.3 泉州中華蜜蜂的遺傳多樣性

泉州各樣點(diǎn)的中華蜜蜂微衛(wèi)星遺傳多樣性水平較為一致.期望雜合度(He)在0.440 7～0.513 1之間，觀察雜合度(Ho)在0.406 2～0.512 4之間，平均多態(tài)信息含量(PIC)在0.409 1～0.476 5之間(表3).根據(jù)微衛(wèi)星數(shù)據(jù)計(jì)算泉州7個(gè)中華蜜蜂樣點(diǎn)間的近交系數(shù)(Fis)范圍在-0.001 2～0.062 1之間.

表3 泉州7個(gè)樣點(diǎn)的微衛(wèi)星和線粒體tRNAleu～COII多樣性參數(shù)

泉州7個(gè)樣點(diǎn)的單倍型共發(fā)現(xiàn)29種，其中泉港、南安的單倍型數(shù)量最多，分別為11種和10種.變異位點(diǎn)數(shù)最多的樣點(diǎn)是南安，有11個(gè)變異和插入缺失位點(diǎn).單倍型多樣性(Hd)的范圍在0.241～0.739，平均核苷酸差異數(shù)(K)為0.339～0.926，核苷酸多樣度(Pi)為0.000 96～0.003 34(表3).

3 討論

本研究對泉州各縣市的中華蜜蜂進(jìn)行了全面的樣本采集，從分子水平和形態(tài)水平了解泉州中華蜜蜂的種群遺傳現(xiàn)狀，明確了泉州中華蜜蜂的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu).33個(gè)形態(tài)標(biāo)記和微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳分化分析表明，雖然泉州市沿海和山區(qū)環(huán)境略有不同，其樣點(diǎn)間中華蜜蜂均未發(fā)生遺傳分化，仍屬于同一種群.通過基因流分析，泉州各樣點(diǎn)的中華蜜蜂基因流水平較高，也說明不具備遺傳分化的條件.在泉州中華蜜蜂遺傳資源保護(hù)和養(yǎng)蜂生產(chǎn)應(yīng)用中，全市區(qū)域可作為一個(gè)整體進(jìn)行規(guī)劃.

本研究中檢測的單倍型數(shù)量比預(yù)期多.建立在大樣本量487個(gè)蜂群的基礎(chǔ)上，在泉州共檢測出29種單倍型，其中有17種未在福建省中華蜜蜂中檢測到，有9種是從未報(bào)道的單倍型[12].泉州中華蜜蜂的單倍型結(jié)構(gòu)與福建省其它地市的中華蜜蜂相似，都是以單倍型Acmt01001為主，占總樣本量的68%[12].泉州這些單倍型信息，特別是新單倍型，為中華蜜蜂種群遺傳學(xué)研究、亞種分類、系統(tǒng)發(fā)育、起源、進(jìn)化、生物地理學(xué)的研究提供了依據(jù).

泉州中華蜜蜂的線粒體遺傳多樣性和微衛(wèi)星遺傳多樣性參數(shù)，均在福建省中華蜜蜂的遺傳多樣性參數(shù)范圍內(nèi)[11-12].與全國其它地區(qū)中華蜜蜂相比，泉州中華蜜蜂處于中度多樣性水平[25-37].但是，泉州中華蜜蜂的微衛(wèi)星多樣性參數(shù)在7個(gè)樣點(diǎn)間差異較小，而線粒體多樣性參數(shù)在不同樣點(diǎn)間的差異較大.并且，各樣點(diǎn)除Acmt01001為主要單倍型外，占樣本量第2的單倍型差異較大，安溪為Acmt01030，德化為Acmt01002，惠安為Acmt01149，晉江為Acmt01016，南安為Acmt01016，泉港為Acmt01022.線粒體是由母系遺傳的，所以這樣的結(jié)果極有可能是由于在少數(shù)蜂群中移蟲育王或遠(yuǎn)距離引種帶來的影響.從保護(hù)地方中華蜜蜂遺傳資源的角度考慮，要避免在少數(shù)蜂群中移蟲育王和遠(yuǎn)距離引種.