韓 莎, 趙 斌, 李成林, 胡 煒, 劉兆存

(1.山東省海洋生物研究院，山東 青島 266104；2.山東黃河三角洲海洋科技有限公司，山東 東營(yíng) 257000)

穩(wěn)定的養(yǎng)殖水體環(huán)境是水生生物賴以生存的關(guān)鍵，水生生物病害及死亡的發(fā)生通常最先由環(huán)境因子的變化所誘導(dǎo)，從而引起養(yǎng)殖生物的應(yīng)激反應(yīng)使其免疫能力下降[1-2].水生生物對(duì)不同的水質(zhì)因子，如溫度[3]、鹽度[4]和氨氮[5]等有不同的適應(yīng)性，在眾多的水質(zhì)理化因子中，pH是能夠反映水質(zhì)狀況的綜合性指標(biāo)，但易受多種因素影響而引起其波動(dòng)或劇烈變化，對(duì)水質(zhì)和水生生物有多方面的影響[6].不同水生生物對(duì)pH的適應(yīng)性不同，同一物種不同規(guī)格及不同地理群體的pH耐受性也存在差異.目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已開(kāi)展大量關(guān)于pH急性脅迫對(duì)水生生物影響的研究，如蝦類[7-9]、蟹類[1]、貝類[2,10]和魚(yú)類[11]等.

近年來(lái)，刺參(ApostichopusjaponicusSelenka)的消費(fèi)需求日益擴(kuò)大，養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展速度和生產(chǎn)規(guī)模均達(dá)到了前所未有的水平，成為我國(guó)海水養(yǎng)殖的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)之一[12-13].刺參養(yǎng)殖方式多樣化，陸基池塘養(yǎng)殖是刺參養(yǎng)殖的主要模式.近年來(lái)，由于異常氣候以及養(yǎng)殖環(huán)境的變化，致使池塘養(yǎng)殖的刺參因水質(zhì)因子過(guò)度變化引起的綜合并發(fā)癥逐年上升，對(duì)我國(guó)刺參陸基養(yǎng)殖以及淺海增殖的產(chǎn)量均造成了嚴(yán)重影響，年損失高達(dá)數(shù)十億元以上，誘發(fā)的次生災(zāi)害更使養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)一度呈現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)[14].通常情況下，pH很少單獨(dú)對(duì)水生生物產(chǎn)生直接毒害，pH能夠與其他環(huán)境因子協(xié)同作用，對(duì)水生生物產(chǎn)生影響.pH作為水質(zhì)關(guān)鍵因子對(duì)刺參生長(zhǎng)、生理及免疫機(jī)能的影響正逐漸成為眾多學(xué)者關(guān)注的問(wèn)題之一，目前已有一些關(guān)于pH脅迫條件下對(duì)刺參存活、生長(zhǎng)、消化和免疫影響的報(bào)道[15-16]，但針對(duì)pH急性脅迫對(duì)刺參免疫調(diào)節(jié)功能的影響尚未見(jiàn)報(bào)道.本試驗(yàn)研究pH突變和時(shí)間效應(yīng)對(duì)刺參非特異性免疫酶活性的影響，從免疫學(xué)角度探討刺參應(yīng)對(duì)pH脅迫的反應(yīng)機(jī)制，旨在為刺參池塘健康養(yǎng)殖、病害防控及其對(duì)環(huán)境適應(yīng)性的研究提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

供試刺參為青島國(guó)家海洋科研中心山東省海洋生物研究院鰲山基地選育的健康苗種.選取體表正常、活力強(qiáng)、攝食良好的刺參苗種暫養(yǎng)于0.2 m3的玻璃鋼槽中，平均體重為(14.56±0.18) g.試驗(yàn)用海水為經(jīng)沉淀沙濾的自然海水，鹽度31.2，水溫(15.8±0.3) ℃，pH 8.2，溶解氧含量≥6.5 mg·L-1，24 h連續(xù)充氣.

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過(guò)預(yù)試驗(yàn)摸索出刺參存活的pH范圍，設(shè)置5個(gè)pH處理組，pH分別為7.3、7.5、8.2、8.9和9.1，每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)3個(gè)平行.其中，低pH處理組的pH分別為7.3和7.5，對(duì)照組的pH為8.2，高pH處理組的pH分別為8.9和9.1.試驗(yàn)在80 cm×60 cm×48 cm的塑料水箱中進(jìn)行，每箱隨機(jī)投放20頭刺參，試驗(yàn)期間停止喂食.用1 mol·L-1鹽酸和1 mol·L-1氫氧化鈉調(diào)節(jié)各試驗(yàn)組相應(yīng)的pH濃度，每天采用多參數(shù)水質(zhì)分析儀校正水體pH 3次，使其維持在試驗(yàn)水平，變化幅度為±0.05個(gè)單位.pH調(diào)節(jié)采取驟降的變化方式，各試驗(yàn)組直接將pH調(diào)節(jié)至設(shè)定的值并保持穩(wěn)定后，開(kāi)始脅迫試驗(yàn).

1.3 樣品的采集、處理及酶活性的測(cè)定

于pH脅迫后的3、6、12、24、48、72和96 h時(shí)采集樣品，每次從每個(gè)平行組隨機(jī)選取2頭刺參，用一次性注射器抽取刺參體腔液，立即將其于1 000 r·min-1離心10 min(4 ℃條件下)，取上清液分裝于滅菌離心管中，放置在冰箱(-80 ℃)中待測(cè).樣品的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)、一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS)和溶菌酶(lysozyme, LZM)活性采用南京建成生物工程研究所研制的試劑盒測(cè)定，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟操作.

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示, 采用SPSS 18.0和Excel 2010軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為顯著差異.

2 結(jié)果與分析

2.1 pH急性脅迫對(duì)刺參SOD活性的影響

pH急性脅迫對(duì)刺參體腔液SOD活性的影響(圖1)顯示：與對(duì)照組相比，低pH處理組的SOD活性隨著脅迫時(shí)間的增加呈現(xiàn)先上升后逐漸下降的趨勢(shì)，6 h時(shí)達(dá)到最大值，pH為7.3、7.5的SOD活性分別為(102.78±1.95)和(98.78±1.86) U·mL-1，與對(duì)照組的差異顯著(P<0.05)，隨后SOD活性逐漸下降，48 h時(shí)下降至對(duì)照組水平(P>0.05)；高pH處理組的SOD活性總體也呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，6 h時(shí)的SOD活性達(dá)到峰值，pH為8.9、9.1的SOD活性分別為(105.73±1.72)和(109.34±1.81) U·mL-1，與對(duì)照組的差異顯著(P<0.05)，48 h時(shí)的SOD活性下降幅度較大，96 h時(shí)的SOD活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05).

2.2 pH急性脅迫對(duì)刺參CAT活性的影響

pH急性脅迫對(duì)刺參體腔液CAT活性的影響(圖2)顯示：與對(duì)照組相比，pH處理組的CAT活性隨著脅迫時(shí)間的增加總體呈現(xiàn)先上升后逐漸下降的趨勢(shì)，12 h時(shí)的CAT活性達(dá)到峰值，且均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，pH為7.3、7.5的CAT活性分別為(18.89±0.48)和(17.83±0.82) U·mL-1，而pH為8.9、9.1的CAT活性分別為(19.52±0.72)和(21.55±0.4) U·mL-1；48 h時(shí)各pH處理組的CAT活性低于對(duì)照組，低pH處理組的CAT活性與對(duì)照組的差異不顯著(P>0.05)，而高pH處理組的CAT活性下降幅度較大，顯著低于對(duì)照組(P<0.05).

2.3 pH急性脅迫對(duì)刺參NOS活性的影響

pH急性脅迫對(duì)刺參體腔液NOS活性的影響(圖3)顯示：低pH處理組的NOS活性變化幅度不大，隨著脅迫時(shí)間的增加總體呈現(xiàn)略有上升后下降的趨勢(shì)，與對(duì)照組的差異不顯著(P>0.05)；高pH處理組的NOS活性隨著脅迫時(shí)間的增加總體呈現(xiàn)短暫下降后上升的趨勢(shì)，24 h時(shí)大幅下降，在96 h時(shí)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，pH為8.9、9.1的NOS活性分別為(11.86±0.34)和(11.35±0.33) U·mL-1.

2.4 pH急性脅迫對(duì)刺參LZM活性的影響

pH急性脅迫對(duì)刺參體腔液LZM活性的影響(圖4)顯示，與對(duì)照組相比，pH處理組的LZM活性隨著脅迫時(shí)間的增加總體呈現(xiàn)略有上升后逐漸下降的趨勢(shì).低pH處理組的LZM活性在24 h時(shí)低于對(duì)照組，72 h時(shí)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；高pH處理組的LZM活性在12 h時(shí)大幅下降，且顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，后略有小幅上升后又下降.與低pH處理組相比較，高pH處理組的LZM活性較低，12 h時(shí)的LZM活性顯著低于低pH處理組(P<0.05).

3 討論

3.1 pH急性脅迫對(duì)刺參非特異性免疫的影響

由于刺參屬于無(wú)脊椎動(dòng)物，只有非特異性免疫[17]，因此，抗氧化系統(tǒng)顯得尤為重要.生物在受到外界脅迫時(shí)，可促使機(jī)體的酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)發(fā)生反應(yīng)，還原產(chǎn)生活性氧和氧自由基，不及時(shí)清除會(huì)造成生物體活性氧損傷[10].抗氧化酶常作為評(píng)估環(huán)境因子脅迫對(duì)生物體產(chǎn)生氧化脅迫效應(yīng)的一類生物標(biāo)志物，氧化應(yīng)激產(chǎn)物的積累會(huì)導(dǎo)致水生生物生理生化功能的缺陷，影響其生長(zhǎng)存活[8,18]，而SOD和CAT是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，也是反映生物應(yīng)對(duì)各種脅迫的重要指標(biāo)[19].本研究結(jié)果表明，隨著pH脅迫時(shí)間的增加，刺參體腔液的SOD和CAT活性呈先上升后下降的趨勢(shì)，分析認(rèn)為，pH脅迫3～12 h時(shí)刺參體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧，機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)被激活.此結(jié)果與“pH急性脅迫下，中國(guó)明對(duì)蝦[18]、脊尾白蝦[8]和縊蟶[10]的酶活性隨著脅迫時(shí)間的增加呈現(xiàn)峰值”的變化結(jié)果相一致.NOS是生物體非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，能夠被誘導(dǎo)產(chǎn)生大量NO，與活性氧中間體等發(fā)生反應(yīng)，從而對(duì)病原生物起到殺滅的作用[20].本研究結(jié)果顯示，隨著pH脅迫時(shí)間的增加，刺參體腔液的NOS活性變化不大，此結(jié)果與趙先銀等[7]的研究結(jié)果一致.養(yǎng)殖水環(huán)境的變化往往會(huì)使水環(huán)境惡化及病菌滋生,導(dǎo)致刺參病原敏感性提高.LZM是一種堿性蛋白酶，能夠破壞和消除進(jìn)入體內(nèi)的異物，增強(qiáng)抗菌因子的抗菌性[21].作為檢測(cè)抗病力的指標(biāo)，本研究結(jié)果顯示，隨著pH脅迫時(shí)間的增加，LZM活性呈逐漸下降的趨勢(shì)，并在脅迫12 h時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)，此時(shí)刺參的病原敏感性最高，這與“3種對(duì)蝦的LZM活性隨著pH脅迫時(shí)間的增加而逐漸下降”的結(jié)果[22]基本一致.

3.2 pH急性脅迫對(duì)刺參的毒性影響

4 結(jié)論

基于本研究結(jié)果，認(rèn)為在刺參養(yǎng)殖的過(guò)程中，針對(duì)pH易于大幅變化的春夏季節(jié)，尤其是鹽堿度較高的養(yǎng)殖區(qū)域，在有效調(diào)控養(yǎng)殖水體pH變化的同時(shí)，還應(yīng)密切注意其他水質(zhì)因子的變化，避免pH與其他因子協(xié)同產(chǎn)生疊加或累加效應(yīng)，定期檢測(cè)刺參SOD、CAT和LZM等敏感免疫指標(biāo)，有助于了解機(jī)體的免疫能力和健康程度，對(duì)減少應(yīng)激、有效預(yù)警和防控病害的發(fā)生具有重要意義.