陳思怡, 鄧明雪, 陳晶偉, 方偉琦, 劉國坤, 肖 順, 程 曦

(福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002)

花生莖線蟲(Ditylenchusarachis)是在我國山東、河北等省花生上發(fā)現(xiàn)的一種新病原線蟲，可導(dǎo)致花生果莢外殼變黑腐爛，種皮變色，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量與品質(zhì)[1].前期研究發(fā)現(xiàn)，花生莖線蟲可以侵染花生的果莢、種粒、胚栓及根莖，主要以幼蟲的形態(tài)在田間殘留的病果莢或種皮上越冬，成為病害的初侵染源，病害主要通過病花生種莢進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播.研究還發(fā)現(xiàn)，從農(nóng)戶家中貯藏的曬干花生果殼和種皮中可分離到大量的活線蟲；將采集的干花生樣本保存于實(shí)驗(yàn)室干燥條件下，2年內(nèi)果莢和種皮中還可分離出大量活的莖線蟲[2-3].這表明花生莖線蟲具備強(qiáng)的耐低溫與抗干燥能力，但其脫水休眠策略及其與線蟲耐低溫能力間的關(guān)系尚不明確.

線蟲脫水休眠(anhydrobiosis)是指一些種類的線蟲在極端的脫水狀態(tài)下可進(jìn)入一種代謝靜止的休眠狀態(tài)，一旦復(fù)水，可恢復(fù)正常的代謝活動[4-5]，如水稻干尖線蟲(Aphelenchoidesbesseyi)、草莓滑刃線蟲(Aphelenchoidesfragariae)、阿姆辛基粒線蟲(Anguinaamsinckia)、剪股穎粒線蟲(Anguinaagrostis)、小麥粒線蟲(Anguinatritici)，以及與花生莖線蟲同屬的甘薯莖線蟲(D.destructor)和鱗球莖莖線蟲(D.dipsaci)[6-7]，均可通過脫水休眠方式度過干燥環(huán)境.這些線蟲通過蟲體卷曲和(或)聚集兩種行為反應(yīng)，以及形態(tài)結(jié)構(gòu)的適應(yīng)性改變，來減少其體內(nèi)水分的喪失[5,7].線蟲脫水存活方式分為緩慢脫水策略型(slow-dehydration strategists)和快速脫水策略型(fast-dehydration strategists)兩大類[8-9]，絕大多數(shù)植物寄生線蟲是通過緩慢脫水策略在干燥環(huán)境下生存，而少數(shù)則采取快速脫水策略[10].溫度是影響線蟲生存和繁殖的重要因素，大多數(shù)植物寄生線蟲在活動階段，不耐低溫，但如果進(jìn)入脫水休眠狀態(tài)后則可忍耐很低的溫度，如鱗球莖莖線蟲處于休眠狀態(tài)時，可在-80 ℃下短期存活[11].然而，花生莖線蟲是如何在北方干冷的條件下越冬，需要進(jìn)一步研究.因此，本研究探討花生莖線蟲的脫水存活方式和耐低溫能力，以及二者的相關(guān)性，以期為進(jìn)一步了解該線蟲的越冬和傳播機(jī)理及制定防控措施提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試線蟲種群培養(yǎng)

供試花生莖線蟲種群DCPXT，采自河北省刑臺花生果莢[1].采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar, PDA)上繁殖的尖孢鐮孢菌(Fusariumoxysporum)菌絲進(jìn)行培養(yǎng)保存[12]：挑取尖孢鐮孢菌接種于培養(yǎng)皿(Φ=6 cm)中的PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)5 d，菌絲長滿培養(yǎng)皿；挑取50條花生莖線蟲雌蟲至離心管，經(jīng)0.2%硫酸鏈霉素浸泡消毒3～6 h，并經(jīng)無菌水清洗3遍后[13]，接種在尖孢鐮孢菌菌絲上，parafilm封口膜封口，28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)25 d左右.

1.2 花生莖線蟲的脫水試驗(yàn)

1.2.1 快速脫水 參照Winston et al[14]和Solomon et al[15]的方法，用蒸餾水、氯化鈉、硝酸鈣和氯化鈣在干燥器內(nèi)制成飽和溶液控制濕度，設(shè)置3個相對濕度：75%、50%和30%.采用改良貝曼漏斗法[16]分離培養(yǎng)的線蟲，制成混合蟲態(tài)線蟲懸浮液(5 000條·mL-1)，取1 mL線蟲懸浮液通過孔徑1.2 μm濾膜(Φ=2.5 cm)過濾，將水濾干后，立即將濾膜分別放入上述3個相對濕度的干燥器內(nèi)，每個濾膜為一個樣本，每個干燥器放置21個樣本，置于黑暗中脫水.每24 h取每個相對濕度處理3個樣本，連續(xù)7 d.將每個樣本分別置于含有5 mL無菌水的小燒杯中，室溫下復(fù)水，12 h后，濾膜上的線蟲進(jìn)入燒杯中，充分搖勻.取1 mL懸浮液置于體視顯微鏡(Nikon SMZ18，含照相系統(tǒng))下，觀察并統(tǒng)計2齡幼蟲(J2)、3齡幼蟲(J3)或4齡幼蟲(J4)(J3、J4在形態(tài)上難以區(qū)分，故合并統(tǒng)計)、雌蟲和雄蟲的存活和死亡數(shù)量，取3次重復(fù)的平均值，計算線蟲的復(fù)蘇率.復(fù)水后，用挑針撥動，蟲體不動、僵直、透明視為死亡線蟲；蟲體彎曲、能動則視為存活線蟲.

1.2.2 緩慢脫水 通過前期預(yù)試驗(yàn)建立了利用Pluronic F-127膠體脫水的方法：在10 ℃下，吸取Pluronic F-127膠體液2 mL于無菌的一次性塑料培養(yǎng)皿(Φ=3.5 cm)中，并加入混合蟲態(tài)線蟲懸浮液(5 000條·mL-1)100 μL，輕搖混勻，移去皿蓋，轉(zhuǎn)移至干燥器中28 ℃干燥處理.每皿為一個樣本，共35個樣本.5 d后，干燥器內(nèi)硅膠球不再變色，膠體已失水成薄片，表明花生莖線蟲隨膠體緩慢失水已進(jìn)入脫水休眠狀態(tài)，取樣并計算此時線蟲復(fù)蘇率，記錄為0.每1周取干燥后的膠體薄片3個樣本，連續(xù)5周，余下的膠體薄片繼續(xù)在干燥器中保存.向干燥后的膠體中加入5 mL無菌水，室溫下復(fù)水12 h，待膠體溶解后，充分搖勻，取1 mL懸浮液置于體視顯微鏡下，觀察線蟲的形態(tài)并統(tǒng)計各蟲態(tài)的存活和死亡數(shù)量，取3次重復(fù)的平均值，計算復(fù)蘇率.

1.3 花生莖線蟲的耐低溫試驗(yàn)

1.3.1 正常培養(yǎng)的線蟲 當(dāng)花生莖線蟲在含有尖孢鐮孢菌的培養(yǎng)基上培養(yǎng)約20 d后，將培養(yǎng)皿分別置于5個低溫環(huán)境(10、4、-10、-20、-80 ℃)下黑暗保存，每1周取一次樣品，每個處理3次重復(fù)，連續(xù)4周，以28 ℃條件下培養(yǎng)的花生莖線蟲作為對照.取樣后，將含有線蟲的PDA樣品在室溫下放置10 min，待其解凍后切碎瓊脂并加入5 mL無菌水浸泡，復(fù)水12 h.取1 mL懸浮液置于體視顯微鏡下，觀察并統(tǒng)計存活和死亡的線蟲總數(shù)，取3次重復(fù)的平均值，計算線蟲的存活率.

1.3.2 脫水休眠狀態(tài)的線蟲 按照1.2.2的處理方法，當(dāng)花生莖線蟲隨膠體緩慢失水進(jìn)入脫水休眠狀態(tài)時，取樣并計算此時線蟲復(fù)蘇率，記錄為0.取出瓊脂膜片，保鮮膜封裝，再裝入自封袋內(nèi)，分別放置在不同低溫環(huán)境(10、4、-10、-20、-80 ℃)下保存，每1周取一次樣品，每個處理3次重復(fù)，連續(xù)5周，對照為同時期在28 ℃下緩慢脫水干燥保存的休眠線蟲.取樣后，將樣品在室溫下放置10 min，加入5 mL無菌水復(fù)水，12 h后統(tǒng)計花生莖線蟲存活和死亡數(shù)量，并計算復(fù)蘇率.

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excel軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，結(jié)合SPSS 20.0軟件對統(tǒng)計的數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析.其中，不同低溫處理下脫水休眠線蟲的復(fù)蘇率采用雙因素方差分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 花生莖線蟲經(jīng)快速脫水處理后的復(fù)蘇率

在75%相對濕度下，花生莖線蟲的復(fù)蘇率在第4天時急劇下降到20.70%，之后趨于穩(wěn)定，第5、6、7天的復(fù)蘇率分別為20.50%、20.10%、17.57%，四者間差異不顯著(圖1)；各蟲態(tài)花生莖線蟲的復(fù)蘇率總體是隨著培養(yǎng)時間的延長而下降，但同一時間不同蟲態(tài)復(fù)蘇率存在顯著差異，干燥處理第7天時，J3+J4占比最高(9.57%)，J2次之(6.13%)，雌蟲和雄蟲復(fù)蘇率最低(表1).在50%相對濕度下，干燥處理第1天花生莖線蟲復(fù)蘇率急劇下降，為9.98%，隨后下降速度減緩，2～7 d復(fù)蘇率為0.25%～4.75%(圖1)；不同蟲態(tài)的復(fù)蘇率表現(xiàn)為J3+J4>J2>成蟲(表1).在30%相對濕度下，花生莖線蟲復(fù)蘇率最低，第1、2、3天復(fù)蘇率分別為4.84%、1.07%、0.02%，第3天存活的線蟲僅為J3和J4，第4天后未見存活的線蟲(圖1)；不同蟲態(tài)的復(fù)蘇率也表現(xiàn)為J3+J4>J2>成蟲(表1).

表1 不同相對濕度下花生莖線蟲各蟲態(tài)的復(fù)蘇率1)

2.2 正常培養(yǎng)的花生莖線蟲耐低溫能力

在28、10和4 ℃條件下，花生莖線蟲保持較高的存活率，4周后的存活率均在80%以上，且差異不顯著；但在-10和-20 ℃條件下，1周后線蟲存活率急劇下降，分別為13.45%和6.93%，第2周未見復(fù)蘇線蟲；在-80 ℃條件下保存1周的線蟲全部死亡(表2).

表2 正常培養(yǎng)的花生莖線蟲在不同溫度下的存活率1)

2.3 花生莖線蟲經(jīng)緩慢脫水處理后的復(fù)蘇率

經(jīng)緩慢脫水進(jìn)入休眠狀態(tài)的線蟲與正常狀態(tài)下培養(yǎng)的線蟲在形態(tài)上不同.正常狀態(tài)下培養(yǎng)的花生莖線蟲蟲體自然彎曲，死亡后蟲體僵直，略向腹面彎曲(圖2A)；但經(jīng)緩慢脫水進(jìn)入休眠狀態(tài)的線蟲身體緊密卷曲，頭部向內(nèi)(圖2B).

由圖3可以看出，在28 ℃條件下緩慢脫水完成后線蟲的平均復(fù)蘇率為56.09%；繼續(xù)干燥保存5周后線蟲復(fù)蘇率急劇下降至0.64%.各蟲態(tài)中，J3+J4的復(fù)蘇率最高，J2次之，二者間存在顯著差異；成蟲的復(fù)蘇率最低，與幼蟲間存在顯著差異(表3).

表3 緩慢脫水處理后各蟲態(tài)的復(fù)蘇率1)

2.4 脫水休眠的花生莖線蟲耐低溫能力

將緩慢脫水休眠線蟲置于低溫條件下保存，線蟲復(fù)蘇率明顯下降，但較28 ℃下保存的復(fù)蘇率高.第5周時，-80 ℃下保存的花生莖線蟲的復(fù)蘇率最高； -10和-20 ℃次之；10和4 ℃保存的線蟲復(fù)蘇率較低(圖3).

3 討論

3.1 花生莖線蟲的脫水策略

本研究明確了花生莖線蟲的脫水存活方式為緩慢脫水策略型，而非快速脫水策略型，且不同蟲態(tài)的抗干燥能力存在差異，表現(xiàn)為J3+J4>J2>成蟲.該結(jié)果與鱗球莖莖線蟲[17]基本一致.有研究認(rèn)為：緩慢脫水策略型，也稱為外部脫水策略型，主要依賴于自然環(huán)境因素，如土壤或周邊生境的緩慢失水，拖延線蟲進(jìn)入致死的最低含水量的時間；而快速脫水策略型，也稱為內(nèi)在脫水策略型，在高度脫水環(huán)境下，線蟲能通過生化及分子適應(yīng)機(jī)制，控制體內(nèi)水分緩慢流失[5,8-9].Womersley[10]研究發(fā)現(xiàn)，大部分線蟲，特別是土壤線蟲，均采用緩慢脫水策略度過干燥的環(huán)境.這些線蟲在脫水時會出現(xiàn)聚集或卷曲兩種狀態(tài)，蟲體卷曲可以減小暴露在干燥環(huán)境中的表面積，減少水分散失速率[18].Treonis et al[19]認(rèn)為線蟲卷曲是其進(jìn)入脫水休眠的指標(biāo)之一.花生莖線蟲在快速脫水時，蟲體大多不呈卷曲狀，但在緩慢脫水休眠時，蟲體絕大多數(shù)呈卷曲狀，表明線蟲卷曲是其緩慢脫水休眠的重要形態(tài)標(biāo)志.

3.2 花生莖線蟲的耐低溫能力

花生莖線蟲的耐低溫能力與其脫水休眠狀態(tài)密切相關(guān).本研究發(fā)現(xiàn)，將花生莖線蟲直接置于低溫下存活率低，但經(jīng)緩慢脫水休眠的線蟲在低溫下能長期存活，甚至在-80 ℃的條件下可保存35 d，復(fù)蘇率達(dá)到31.75%.這表明花生莖線蟲可能是通過一種保護(hù)性脫水的策略[20]來抵御低溫的影響：當(dāng)線蟲進(jìn)入脫水休眠狀態(tài)后，新陳代謝受抑制，待環(huán)境條件適宜后，其體內(nèi)線粒體活動水平提高，從而提供足夠能量使其復(fù)蘇.當(dāng)鱗球莖莖線蟲在干燥環(huán)境中處于休眠狀態(tài)時，可在-80 ℃存活20 min[11].目前，除了花生莖線蟲以外，只有極地生活的線蟲休眠狀態(tài)下能在-80 ℃存活35 d以上[20].

本研究為揭示花生莖線蟲在北方花生主產(chǎn)區(qū)越冬存活的機(jī)理提供了依據(jù).由于北方冬季干冷，在土壤、病殘組織內(nèi)的線蟲可以通過緩慢脫水的方式進(jìn)入休眠狀態(tài)，其耐干燥能力和耐低溫能力強(qiáng)，使其可以順利越冬，在溫度適宜的環(huán)境下復(fù)蘇率高，且其生活史短、繁殖能力強(qiáng)，即使復(fù)蘇后的線蟲數(shù)量少，也可以在花生生長季節(jié)對花生產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴(yán)重影響.