張生杰，龐文娟，王 麗

(武威市藥品檢驗檢測中心，甘肅 武威 733000)

白芍為毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根，具有平肝止痛、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)、斂陰止汗等功效，臨床用于治療頭痛眩暈、脅痛、腹痛、四肢攣痛、血虛萎黃、月經(jīng)不調(diào)、自汗、盜汗等[1]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)其化學(xué)成分主要包括單萜及其苷類、三萜類、黃酮、鞣質(zhì)、多糖、揮發(fā)油等物質(zhì)，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗氧化、抗癌、抗抑郁和抗肝纖維化等作用；對自身免疫性疾病、心腦血管疾病和神經(jīng)退行性疾病也能起到改善和治療作用[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，白芍通過阻斷Toll樣受體4/5信號通路，抑制樹突狀細胞的功能，從而減輕了免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[3]，白芍主要成分芍藥總苷可通過下調(diào)E1B19k/Bcl-2結(jié)合蛋白Nip3基因表達，上調(diào)Kruppel型鋅指蛋白、紫外切除修復(fù)蛋白RAD23同族體B和熱休克蛋白1基因表達來抑制腫瘤[4]，通過阻斷TGF-β1/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮抗肝纖維化作用[5]。不過盡管對白芍藥理學(xué)研究已有較多報道，但均未系統(tǒng)整體探討其成分、靶點、疾病、通路之間的相互聯(lián)系。

中藥具有多成分、多靶點、調(diào)節(jié)方式多樣的特點，蘊含了極大的信息量，采用西醫(yī)單靶標、單成分的研究思路來研究中藥，很難體現(xiàn)中藥的系統(tǒng)性[6]。自2007年HOPKINS[7]首次提出了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)(network pharmacology)研究方法，該方法即廣泛應(yīng)用于闡釋中藥藥理機制[8]、探究中藥的毒性機制[9]等，改變了傳統(tǒng)新藥研發(fā)“一個藥物、一個靶標、一種疾病”的理念。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用的基礎(chǔ)上，通過網(wǎng)絡(luò)分析，以網(wǎng)絡(luò)靶點為切入點，從整體生物網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定角度分析藥物分子與疾病網(wǎng)絡(luò)之間的關(guān)聯(lián)。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)分析白芍藥理作用機制，為其開發(fā)利用提供參考。

1 資料與方法

1.1 活性成分篩選

采用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(TCMSP)(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php)分析平臺，以“白芍”為關(guān)鍵詞檢索其活性成分及靶點。以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，化合物類藥性(drug-like，DL)≥0.18為篩選條件，再結(jié)合文獻挖掘與整理，依據(jù)化合物在單味藥中的含量、研究熱度等標準篩選出已報道的白芍活性成分[10]。

1.2 活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將得到的白芍活性成分所對應(yīng)的靶點通過UniProt數(shù)據(jù)庫(http：//www.uniprot.org/uploadlists/)翻譯成相應(yīng)基因，所有靶點均為人源化。再將化合物及相應(yīng)基因?qū)隒ytoscape3.6.1軟件，繪制白芍活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。在Cytoscape軟件網(wǎng)絡(luò)圖中，每個節(jié)點(node)是基因、蛋白或化合物，節(jié)點與節(jié)點之間的連接(edge)代表這些生物分子之間的相互關(guān)系，度值(degree)表示網(wǎng)絡(luò)圖中節(jié)點之間的連接數(shù)目，化合物度值越大，說明該化合物與多個靶點有關(guān)系，在疾病治療中起關(guān)鍵作用。

1.3 靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通過TCMSP平臺尋找與18個候選化合物相關(guān)的潛在靶點，并根據(jù)得出的靶點在TCMSP平臺中找出相關(guān)的疾病，導(dǎo)入Cytoscape3.6.1軟件，構(gòu)建靶點-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。用節(jié)點的大小和顏色表示degree值的大小，節(jié)點越大、顏色由黃到紅表示degree值越大；用粗細表示靶點與疾病之間的相互關(guān)系，邊越粗表示關(guān)系越緊密。

1.4 靶蛋白相互作用(PPI)

網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及hub基因篩選為明確白芍潛在靶蛋白之間的相互作用，將篩選得到的靶蛋白在STRING平臺(https：//string-db. org/)構(gòu)建蛋靶白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)模型，將蛋白種類設(shè)置為“Homo sapiens(人類)”進行操作，最低相互作用閾值設(shè)為中等置信度 0.4“medium confidence”，其余參數(shù)保持默認設(shè)置。以PPI網(wǎng)絡(luò)連線的粗細代表相互的強弱，靶點的度值(Degree)表示相互作用的靶點個數(shù)。將PPI網(wǎng)絡(luò)模型導(dǎo)入Cytoscape3.6.1軟件，運用網(wǎng)絡(luò)分析CytoHubba插件篩選核心基因(hub gene)，采用最大集團中心性(Maximal clique centrality，MCC)的拓撲算法，核心基因?qū)?yīng)的蛋白質(zhì)即為具有重要生理調(diào)節(jié)功能的核心蛋白。

1.5 GO功能富集與KEGG信號通路分析

應(yīng)用基因注釋及功能富集數(shù)據(jù)庫 DAVID 6.8(https：//david.ncifcrf.gov/)，對白芍潛在靶點進行基因本體論(Gene ontology，GO)功能富集分析，研究藥物靶點生物過程，在京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)進行信號通路富集分析，研究藥物靶點主要信號通路。

2 結(jié)果

2.1 白芍活性成分篩選

通過(TCMSP)篩選，得到白芍85個化合物分子中有14個符合條件，結(jié)合文獻挖掘與整理篩選出4個已報道的白芍活性成分丹皮酚[11]、熊果酸[12]、氧化芍藥苷[13]、沒食子酸甲酯[14]共計18個化合物作為候選化合物，見表1。

2.2 主要活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

在TCMSP平臺檢索18個候選化合物的作用靶點，其中12個化合物檢索出146個相應(yīng)靶點，6個化合物未檢索出對應(yīng)靶點，以此構(gòu)建白芍化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，包含106個節(jié)點、274條邊，其中12個紫色節(jié)點代表了白芍的活性成分，94個藍色節(jié)點代表了靶點，274條邊代表了化學(xué)成分與靶點的相互作用，通過活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn)白芍中山柰酚、兒茶素、丹皮酚、芍藥苷、芍藥苷元、芍藥二酮、β-谷甾醇、谷甾醇、沒食子酸甲酯、齊墩果酸、反亞油酸甲酯、丁子香萜在白芍藥理中發(fā)揮了重要作用，見圖 1。

表1 白芍活性成分篩選結(jié)果

圖1 白芍活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

2.3 靶點-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)分析

潛在靶點與相關(guān)疾病構(gòu)建的靶點-疾病相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖，由246個節(jié)點，包括46個靶點節(jié)點、200個疾病節(jié)點和378條邊組成，94個靶點中有48個靶點在靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)圖中沒有相對應(yīng)的疾病，說明還存在尚未被發(fā)現(xiàn)的作用途徑。網(wǎng)絡(luò)圖中PTGS2(前列腺素G /H合酶2)的degree值最大，與32種疾病相關(guān)，包括炎癥、惡性腫瘤、痛癥、心血管疾病等，這與現(xiàn)代藥理實驗結(jié)論相吻合[15-16]。又如PPARG(過氧化物酶體增生激活受體γ)參與調(diào)節(jié)了21種不同的疾病，包括胰腺癌、胰腺癌、膀胱癌、動脈粥樣硬化、哮喘、炎癥、糖尿病、肥胖癥等。篩選出degree>3的17種疾病，乳腺癌(9)、非特異性癌癥(9)、哮喘(8)、慢性炎癥(8)、炎癥(6)、前列腺癌(6)、克羅恩氏病(5)、焦慮癥(5)、阿爾茨海默氏病(5)、心臟衰竭(4)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(4)、精神分裂癥(4)、胰腺癌(4)、膀胱癌(4)、糖尿病(4)、骨關(guān)節(jié)炎(4)、心肌梗塞(4)，由此可見，白芍在這些疾病的治療中發(fā)揮了一定作用，這與白芍抗炎、鎮(zhèn)痛、抗癌、抗抑郁的功效相吻合。見圖2。

圖2 白芍靶點與疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.4 靶蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及hub基因篩選

將白芍94個靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，限定物種為“人”，構(gòu)建蛋白相互作用關(guān)系，其中一些蛋白與其他蛋白沒有相互關(guān)系，將不再在相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖中體現(xiàn)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)。圖3中節(jié)點代表蛋白，邊表示蛋白之間的相互關(guān)系，共有87個節(jié)點、702條邊。用節(jié)點的大小和顏色表示degree值的大小，節(jié)點越大、顏色由紅到藍表示degree值越大，用邊的粗細表示蛋白之間的相互關(guān)系Combine-score，邊越粗表示Combine-score值越大，說明蛋白之間的關(guān)系越緊密。根據(jù)Cytoscape軟件Cytohubba插件，MCC算法計算前10個關(guān)鍵基因(AKT1、IL6、TNF、JUN、PTGS2、MAPK8、CASP3、MAPK1、ICAM1、VCAM1)，提示這些關(guān)鍵基因在白芍藥理機制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。見圖4。

2.5 GO生物過程富集結(jié)果

對白芍94個靶基因進行GO生物過程富集，GO注釋分為三大類，分別是：分子生物學(xué)功能(Molecular function，MF)、生物學(xué)過程(Biological process，BP)和細胞學(xué)組分(Cellular components，CC)。通過這三個功能，對一個基因的功能進行多方面的限定和描述[17]，通過DAVID數(shù)據(jù)庫以人類基因為背景對白芍預(yù)測靶點GO進行生物過程富集分析(P<0.05)，圖5-圖7分別列出了顯著性較高的10種。從結(jié)果來看白芍活性成分作用的靶點主要富集在分子功能的正調(diào)節(jié)、細胞凋亡的調(diào)控、程序性細胞死亡的調(diào)控、細胞死亡的調(diào)控、細胞增殖調(diào)控等生物過程中，在細胞組成方面，細胞分子、不溶性組分、微粒體、泡狀部分、膜組分占比較高；在分子功能方面，腎上腺素受體活性、胺受體活性、α腎上腺素能受體活性、藥物結(jié)合排在前列。

圖3 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖4 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵基因(hub)基因篩選

圖5 白芍活性成分靶點的BP富集分析(一)

圖6 白芍活性成分靶點的BP富集分析(二)

圖7 白芍活性成分靶點的BP富集分析(三)

2.6 KEGG信號通路富集結(jié)果

對白芍94個靶點進行KEGG信號通路富集，根據(jù)P<0.05篩選出前20條信號通路，分別為癌癥通路、Toll樣受體信號通路、細胞凋亡、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、NOD樣受體信號通路、前列腺癌、肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)、小細胞肺癌、II型糖尿病、T細胞受體信號通路、鈣信號通路、結(jié)直腸癌、細胞色素P450對外源物質(zhì)代謝的影響、色氨酸代謝、神經(jīng)營養(yǎng)素信號通路、脂肪細胞因子信號途徑、胰腺癌、B細胞受體信號通路、孕酮介導(dǎo)的卵母細胞成熟、藥物代謝信號通路(圖8)。白芍可以通過Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路、T細胞受體信號通路、B細胞受體信號通路等途徑發(fā)揮抗炎免疫調(diào)節(jié)的作用[18]，現(xiàn)已開發(fā)成上市藥物(白芍總苷膠囊)，常用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[19]；也可以作用于癌癥的細胞凋亡、前列腺癌、小細胞肺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌等多條癌癥相關(guān)途徑以抑制腫瘤的生長，誘導(dǎo)癌細胞凋亡；通過細胞色素P450對外源物質(zhì)代謝的影響[20]、藥物代謝信號通路發(fā)揮保肝功效。表明白芍的活性成分可以作用于這些信號通路發(fā)揮藥理作用。

圖8 白芍靶點的KEGG通路

3 討論

白芍作為理氣止痛、疏肝解郁良藥，有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛、抗抑郁功效，但作用機制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析與中醫(yī)藥整體觀的思想基本一致，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法有助于闡釋白芍物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機制。本研究檢索出白芍84個化學(xué)成分，通過條件篩選選出12個化合物作為白芍主要活性成分，且大多數(shù)都符合Lipinski五規(guī)則[21]，化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖顯示了白藥多成分、多靶點相互作用的特點，其主要通過山柰酚、兒茶素、丹皮酚、芍藥苷、芍藥苷元、芍藥二酮、β-谷甾醇、谷甾醇、沒食子酸甲酯、齊墩果酸、反亞油酸甲酯、丁子香萜發(fā)揮藥理作用。

藥物靶點被視為藥物在機體內(nèi)的作用結(jié)合位點，包括基因位點、受體、酶、離子通道、核酸等生物大分子等，選擇確定新穎的有效藥物靶點在新藥研發(fā)中具有重要意義[22]。對白芍靶點-疾病相互作用網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)PTGS2、PPARG、TNF、HSP90AB1、ALOX5、CYP1A2等是白芍抗炎、疼痛、抗抑郁、抗腫瘤的關(guān)鍵靶點，同時也發(fā)現(xiàn)TNF、ADRB2、PDE3A、PPARG、CYP1A2、SELE、ALOX5多個靶點對哮喘有明確的相互作用，但目前并沒有與此相關(guān)的文獻報道，提示可以開展與其作用機制相關(guān)的研究，并將其運用到臨床哮喘的治療，此外靶點PPARG、PTGS2、SELE、ALOX5對銀屑病具有靶向作用，TNF、HTR2A、PPARGV、DPP4、INSR對糖尿病具有靶向作用，這對研究開發(fā)白芍新的適應(yīng)證具有指導(dǎo)意義。

通過對白芍作用蛋白的相互作用分析，白芍靶蛋白之間是一個相互交錯的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，并非單獨發(fā)揮作用。其中AKT1、PTGS2、TNF、JUN、VCAM1、CASP3、ICAM1、IL-6、MAPK8、MAPK1是治療疾病的核心靶點，白芍發(fā)揮藥理作用離不開這些關(guān)鍵靶蛋白的直接或者間接作用，如AKT1編碼的AKT蛋白細胞生長信號通路中的傳感器，在生長因子或胰島素介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中扮演重要的角色，在營養(yǎng)代謝、細胞生長、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細胞存活中也具有重要作用[23]。ICAM1和VCAM1都是免疫球蛋白超家族成員，在炎癥性細胞因子作用下，其通常在內(nèi)皮細胞和免疫系統(tǒng)細胞上表達，會導(dǎo)致炎癥分子的集中，從而產(chǎn)生炎癥，ICAM1在調(diào)解細胞與細胞間的炎癥反應(yīng)中起重要作用[24-25]。PTGS2可將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素H2，PTGS2上調(diào)與細胞黏附增加、表型變化、細胞凋亡和腫瘤血管生成有關(guān)，具有抗炎抗氧化作用[26]，從而揭示白芍抗炎作用機制。此外，TNF是一種能夠直接殺傷腫瘤細胞而對正常細胞無明顯毒性的細胞因子，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的直接殺傷腫瘤作用最強的生物活性因子之一[27]，Caspases-3在細胞凋亡中具有不可替代的作用，IL-6能夠刺激參與免疫反應(yīng)的細胞增殖，分化并提高其功能對研究白芍抗腫瘤、提高免疫力具有重要的指導(dǎo)意義。

GO富集分析和KEGG通路注釋分析結(jié)果表明，白芍主要活性成分靶點主要通過分子功能正調(diào)節(jié)、細胞凋亡的調(diào)控、程序性細胞死亡的調(diào)控、細胞死亡的調(diào)控、細胞增殖調(diào)控在細胞分子、不溶性組分、微粒體、泡狀部分、膜組分上發(fā)生腎上腺素受體活性、胺受體活性、α腎上腺素能受體活性、藥物結(jié)合等分子反應(yīng)。從KEGG信號通路富集來看，白芍主要涉及癌癥的途徑、Toll樣受體信號通路、細胞凋亡、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、NOD樣受體信號通路、前列腺癌、肌萎縮側(cè)索硬化癥、小細胞肺癌、Ⅱ型糖尿病、T細胞受體信號通路等反應(yīng)，白芍主要通過這些信號通路發(fā)揮抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、保肝作用。此外白芍可以作用于肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)、色氨酸代謝信號途徑，為開發(fā)治療肌肉萎縮新藥提供了途徑[28]。相關(guān)實驗也證明了這些信號通路的存在，在人臍靜脈內(nèi)皮細胞中，芍藥苷能夠抑制溶血卵磷脂誘導(dǎo)的炎性因子的產(chǎn)生，這種抑制作用與高遷移率族蛋白B1-晚期糖基化終產(chǎn)物/Toll樣受體2 /Toll樣受體4-NF-κB信號通路有關(guān)[29]。

綜上所述，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)研究白芍物質(zhì)基礎(chǔ)和藥理作用機制，符合中藥多成分、多靶點、調(diào)節(jié)方式多樣性的特點，上述預(yù)測靶點與已知文獻報道的藥理作用相吻合，說明了預(yù)測靶點的準確性。不過現(xiàn)有文獻多集中在白藥抗炎機制的研究，對抗腫瘤、提高機體免疫力方面的報道較少，今后需加強在這些方面的研究，為白芍的開發(fā)利用提供新的思路。