李 龍，仇薪鑫，閆紅軍

(楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物工程分院，陜西 楊凌 712100)

禽霍亂是由多殺性巴氏桿菌引起的家禽出血性白血病[1]，由于多重耐藥菌的出現(xiàn)，造成抗生素使用效果受限[2]，因此疫苗仍是該病的主要防控手段。目前市場上出售的疫苗多為單一或多個血清型多殺性巴氏桿菌滅活苗或弱毒苗，但滅活疫苗和弱毒疫苗存在免疫原性弱、風(fēng)險大和貯存運輸不便等缺點，限制了它們的發(fā)展與應(yīng)用[3]。細菌菌影是一種不含核酸、胞漿等物質(zhì)的細菌空殼[4]。菌影既兼有活菌的天然形態(tài)和免疫原性，同時又兼有滅活菌的高效安全性。目前已報道的菌影主要通過裂解基因和化學(xué)試劑2種方法制備，通過處理在細胞壁上形成裂解通道或小孔，促使細菌內(nèi)容物釋放，細菌死亡[5-7]，其中化學(xué)法相比于基因裂解法更簡單、高效和安全[8]。前期我們利用化學(xué)法成功制備出禽多殺性巴氏桿菌菌影(已接受，待刊)，但其在活體中的使用效果還不清楚，因此本試驗擬通過皮下注射、靜脈注射和口服3種方式接種，在蛋雞上對禽多殺性巴氏桿菌菌影免疫效果進行活體評價，為菌影應(yīng)用于家禽多殺性巴氏桿菌病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 選擇80只12周齡健康的海蘭灰母雞，飼養(yǎng)溫度21～27 ℃，整個飼養(yǎng)期內(nèi)雞只自由采食和飲水。

1.2 免疫和攻毒 將雞只隨機分為4組，分別命名為A、B、C組和D組，每組20只，A組雞只皮下注射0.5 mL滅菌PBS，B、C組和D組雞只分別通過口服、皮下注射和靜脈注射3種方式免疫接種0.5 mL制備好的巴氏桿菌菌影(P.multocidaghosts，PMGs)，接種量為2×106菌影細胞/mL，雞只免疫2次，一免在飼養(yǎng)1周時，二免在飼養(yǎng)3周時，免疫間隔為2周。在二免后2周所有雞只通過靜脈注射攻毒禽多殺性巴氏桿菌菌株(CVCC474，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)，攻毒量為2×108CFU。攻毒后2周統(tǒng)計雞只死亡率，每次免疫后2周和攻毒后2周雞只翅靜脈采血備用。

1.3 IgG濃度測定 為了測定菌影免疫下雞只體液免疫情況，分別在一免前和二免后分離雞血清，利用雞IgG ELISA試劑盒(ZY-IgG-Ch，上海澤葉生物科技有限公司)測定雞只血清中的IgG濃度，操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4 流式細胞儀分析 為了測定菌影免疫下雞只細胞免疫情況，在二免2周后雞只翅靜脈抗凝采血，加入PBS(pH值=7.4)將抗凝血進行1∶1稀釋，稀釋全血355 g離心20 min，用毛細管緩慢收集外周血白細胞，無菌PBS洗脫3次，分離的外周血白細胞利用FITC標記的雞CD4+和CD8+單克隆抗體染色后利用流式細胞儀(美國BD)上機檢測，根據(jù)熒光活化細胞分檢器(Fluorescence-activated cell sorter,FACS)分析，統(tǒng)計出CD4+和CD8+所占的百分含量。

1.5 血清抗菌能力測定 參照Vinod N等[8](2015年)推薦的方法進行。將100 mL巴氏桿菌菌懸液(1×106CFU/mL)加入25 mL血清中，室溫靜置1 h將涂板進行細菌計數(shù)，以滅菌的PBS處理作為對照，利用公式計算血清抗菌力，血清抗菌力=[1-(血清處理后細菌數(shù)量/PBS處理細菌數(shù)量)]×100%。

1.6 巴氏桿菌計數(shù) 在攻毒后2周，每組隨機選擇8只雞屠宰，無菌取出肝臟、肺臟、脾臟和腎臟，稱重后加入5 mL滅菌PBS，勻漿處理，10倍梯度稀釋，取稀釋液100 μL均勻涂板計數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 試驗數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，利用LSD post-hoc進行多重比較，試驗結(jié)果采用平均值±標準差(Mean ±SD)表示，以P<0.05判定結(jié)果為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 體液免疫反應(yīng) 結(jié)果見圖1。在飼養(yǎng)1周未免疫前，所有組別在血清IgG水平上并無差異(P>0.05)，但在一免和二免后相對于對照組(A組)，菌影免疫組(B、C組和D組)血清IgG水平顯著提高(P<0.05)，3個免疫組之間并無顯著差異(P>0.05)。而在攻毒后與對照組相比，免疫組血清IgG水平均顯著提高(P<0.05)，其中C組IgG抗體水平最高。

圖1 PMGs免疫對雞只IgG抗體水平的影響Fig.1 Effect of PMGs on IgG level on chickens與A組相比差異顯著，*:P<0.05;下圖同Compare to group A,*：P<0.05.The same as below

2.2 體液免疫反應(yīng) 結(jié)果見圖2。在二免后2周相比于對照組(A組)，免疫組(B、C組和D組)外周血白細胞中CD4+和CD8+T細胞的百分含量顯著提高(P<0.05)，其中C組的CD4+和CD8+T細胞的百分含量最高，而各免疫組(B、C組和D組)之間并無顯著差異(P>0.05)。

圖2 PMGs免疫對CD4+(A)和CD8+(B) T細胞百分含量的影響Fig.2 Effect of PMGs on CD4+ (A) and CD8+(B) T cells level on chickens

2.3 血清抗菌力 結(jié)果見圖3和圖4。在飼養(yǎng)1周未免疫前，所有組別血清抗菌力上并無顯著差異，但在一免和二免后2周免疫組(B、C組和D組)相比于對照組(A組)血清抗菌力均顯著提高(P<0.05)(圖3)。而在雞只攻毒后，菌影免疫組(B、C組和D組)相比于對照組肝臟、脾臟、肺臟和腎臟中巴氏桿菌的數(shù)量顯著降低(P<0.05)，而各免疫組(B、C組和D組)之間并無顯著差異(P>0.05)(圖4)。

圖3 PMGs免疫對血清抗菌力的影響Fig.3 Effect of PMGs on serum bactericidal activities on chickens

圖4 PMGs免疫對攻毒后臟器巴氏桿菌負載量的影響Fig.4 Effect of PMGs on bacterial loads in visceral organ on chickens

2.4 保護率 結(jié)果見表1。在二免后2周，每組雞只攻毒高致病性多殺性巴氏桿菌2周后，免疫組(B、C組和D組)的保護率為100%，而未免疫組(A組)的保護率只有50%。

表1 攻毒下雞只的存活率Table 1 The survival of chickens after immunized with Pasteurella multocida

3 討論

已有研究發(fā)現(xiàn)，單一的一種多殺性巴氏桿菌外膜成分還不能夠有效的防治禽霍亂的發(fā)生，而完整的細胞壁成分在多殺性巴氏桿菌疫苗發(fā)揮高效的免疫保護過程中起到重要作用[9]。與其他滅活疫苗相比，菌影疫苗的優(yōu)勢是可以保留完整的病原菌表面抗原，可以作為天然的免疫佐劑[10]。細菌菌影疫苗能夠誘導(dǎo)動物機體產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫，降低病原菌感染的風(fēng)險[11-12]。Marandi M V等[13](1997年)報道接種膜蛋白OmpA能顯著增加小鼠IgG的分泌，降低多殺性巴氏桿菌感染小鼠的死亡率，提示體液免疫參與了動物體抵抗多殺性巴氏桿菌感染。此外，多殺性巴氏桿菌膜蛋白OmpA同樣表現(xiàn)出了良好的免疫原性，能夠提高動物體體液免疫水平[14]。在本試驗中同樣發(fā)現(xiàn)，雞只免疫PMGs后IgG抗體水平顯著提高，提示PMGs免疫能夠顯著提高雞只體液免疫水平。CD4+T細胞能夠促進IgG抗體的分泌和細胞免疫反應(yīng)，而CD8+T細胞能夠破壞入侵到細胞內(nèi)的病原微生物[15-16]。已有研究表明，多殺性巴氏桿菌中的脂多糖能夠誘導(dǎo)機體CD4+和CD8+T細胞的增殖[17]，本試驗同樣發(fā)現(xiàn)，完整細胞外膜結(jié)構(gòu)的PMGs同樣能夠顯著提高雞只CD4+和CD8+T細胞百分比，誘導(dǎo)CD4+和CD8+T細胞增殖，提高雞只細胞免疫水平。

集約化養(yǎng)殖模式下家禽飼養(yǎng)量巨大，而傳統(tǒng)的免疫方式如注射、刺種、滴眼和滴鼻等造成實際生產(chǎn)中工作量大、雞只免疫應(yīng)激強度大等缺陷。而本試驗發(fā)現(xiàn)，通過皮下注射、靜脈注射和口服3種免疫途徑，PMGs均能提高雞只的體液免疫和細胞免疫水平，減少臟器病原菌負載和死亡率，3種免疫方式表現(xiàn)出了相同的免疫效果。Vinod N等[8](2015年)研究同樣發(fā)現(xiàn)，通過化學(xué)法制備的革蘭陽性菌金黃色葡萄球菌菌影疫苗通過不同的接種途徑下小鼠獲得了相同的免疫效果。這些結(jié)果提示，PMGs可通過口服的方式接種家禽，簡單易行，減少工作量和雞只應(yīng)激，在未來的實際推廣中有廣闊的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

本試驗發(fā)現(xiàn)通過化學(xué)法制備的多殺性巴氏桿菌菌影在皮下注射、靜脈注射和口服3種免疫方式下均能夠顯著提高雞只體液免疫和細胞免疫水平，并在多殺性巴氏桿菌感染下對雞只有很強的保護作用，這對未來開發(fā)家禽多殺性巴氏桿菌疫苗提供了新的途徑。