黃超華，曹琛福，阮周曦，史衛(wèi)軍，林彥星，曾少靈，劉建利，王 瀟，陳金頂，花群義

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.深圳海關(guān)動植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東 深圳 518045)

藍(lán)舌病(Bluetongue，BT)是一種感染包括山羊、牛、綿羊及野生反芻動物的蟲媒性傳染病，其病原為藍(lán)舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)，主要通過雌性庫蠓叮咬進(jìn)行傳播[1]。BT的流行和暴發(fā)會帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，包括感染動物大批死亡和被撲殺等直接損失，以及疫病監(jiān)測、動物免疫、畜產(chǎn)品出口受限的間接損失，為此加強(qiáng)BT的預(yù)防和控制對畜牧業(yè)發(fā)展至關(guān)重要[2-3]。

BTV在分類學(xué)上屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)環(huán)狀病毒屬(Orbivirus)的藍(lán)舌病病毒亞群，目前已發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)共有31個血清型。BTV基因組可編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白和5種非結(jié)構(gòu)蛋白。NS3蛋白是BTV的一種非結(jié)構(gòu)蛋白，由BTVS10編碼而成，其氨基酸序列及核苷酸序列均高度保守，具有群抗原特異性。研究者發(fā)現(xiàn)，NS3蛋白作為BTV唯一的糖蛋白，具有類似病毒孔蛋白的功能，參與成熟的BTV粒子從宿主細(xì)胞的釋放過程[4-6]。同時，NS3在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于昆蟲細(xì)胞中；自然感染的動物與滅活疫苗接種的動物體內(nèi)針對NS3的抗體水平也存在較為顯著的差異，可作為一種區(qū)分自然感染和疫苗接種的鑒別診斷抗原[7-9]。本試驗(yàn)利用昆蟲桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)藍(lán)舌病病毒8型NS3蛋白，并通過間接免疫熒光、Western Blot和間接ELISA等手段對其反應(yīng)原性進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 菌株、血清和細(xì)胞 pFastBac-HTA質(zhì)粒為Invitrogen公司產(chǎn)品；BTV綿羊陽性血清、兔抗藍(lán)舌病病毒NS3蛋白(原核表達(dá))多抗和昆蟲細(xì)胞Sf9均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 Cellfectin?II Reagent、SF-900Ⅲ培養(yǎng)基、PureLinkTMHiPure質(zhì)粒純化試劑盒，均為Invitrogen公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶以及Taq酶、感受態(tài)細(xì)胞DH5α，均為TaKaRa公司產(chǎn)品；所使用的抗體均為Abcam公司產(chǎn)品；TMB顯色試劑盒為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品。

1.3 基因合成 以參考基因 BTV8S10 AM498060.1為模板，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，BTVNS3整個開放閱讀框(ORF)，獲得重組質(zhì)粒pUC-BTV8-NS3，其中NS3全長約703 bp，并在上下游分別引入BamH I、EcoR I 兩個酶切位點(diǎn)。合成引物：上游引物(BamH I)：5′-GGATCCGATGCTATCCGGGCTGATCC-3′；下游引物(EcoR I)：5′-GAATTCTCAGGTTAATGGCATTTCGA-3′；M13上下游引物見Invitrogen公司Bac-to-Bac?TOPO?Expression System User Manual。

1.4 重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-NS3的構(gòu)建 按照常規(guī)的分子克隆技術(shù)，即雙酶切、T4連接、轉(zhuǎn)化、菌落PCR和雙酶切鑒定等方法，將BTV8NS3 序列插入至pFastBac-HTA獲得重組質(zhì)粒pFastBac-HTA-NS3；通過熱轉(zhuǎn)化的方式將重組質(zhì)粒pFastBac-HTA-NS3轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞DH10Bac中，藍(lán)白斑篩選。挑取單個白色菌落，進(jìn)行菌落PCR鑒定，確定NS3是否轉(zhuǎn)座成功。鑒定結(jié)果為陽性的菌落過夜大量培養(yǎng)，并用PureLinkTMHiPure質(zhì)粒純化試劑盒大量提取純化重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-NS3。

1.5 重組桿狀病毒rBac-NS3的獲得 用轉(zhuǎn)染試劑盒Cellfectin?Ⅱ Reagent將重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-NS3轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，設(shè)空白對照，持續(xù)觀察細(xì)胞病變情況。在細(xì)胞病變明顯時，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，即P1代重組桿狀病毒rBac-NS3，并繼續(xù)傳代以提高重組桿狀病毒的滴度。

1.6 NS3蛋白的表達(dá)與純化 將無血清培養(yǎng)的Sf9細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶至75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中(70%～80%)。貼壁1 h后，接入適量的重組桿狀病毒rBac-NS3，72 h收集細(xì)胞、充分裂解并離心收集細(xì)胞裂解上清。大量收集細(xì)胞裂解上清。使用Ni-NTA Fast Start Kit試劑盒純化重組NS3蛋白。

1.7 間接免疫熒光試驗(yàn) 將Sf9細(xì)胞接種至24孔培養(yǎng)板中，貼壁1 h后，接種重組桿狀病毒rBac-NS3，28 ℃培養(yǎng)72 h。棄去培養(yǎng)液，PBST洗滌后，加入預(yù)冷的4%多聚甲醛，室溫固定1 h；PBST洗滌后，加入1% Triton X-100，室溫通透1 h；洗滌后，加入封閉液室溫封閉2 h；棄封閉液，加入兔抗藍(lán)舌病病毒NS3蛋白(原核表達(dá))多抗，4 ℃孵育過夜；洗滌后，加入Goat Anti-Rabbit IgG H&L(FITC)(1∶200稀釋)，37 ℃避光孵育30 min；洗滌后，倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.8 SDS-PAGE和Western Blot檢測 通過SDS-PAGE和Western Blot方法確認(rèn)NS3蛋白的純化效果和反應(yīng)原性。按照常規(guī)步驟進(jìn)行SDS-PAGE電泳和轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后，分別以Anti-His單抗(1∶5 000稀釋)和綿羊BTV陽性血清(1∶500稀釋)為一抗，以Rabbit Anti-Mouse IgG H&L(HRP)(1∶5 000)和Rabbit Anti-SheepIgG H&L(HRP)(1∶5 000)為二抗，進(jìn)行Western Blot。

1.9 間接ELISA方法驗(yàn)證NS3蛋白的反應(yīng)原性 為進(jìn)一步驗(yàn)證重組蛋白NS3的反應(yīng)原性，以純化的蛋白NS3為包被蛋白，建立一種間接ELISA。并以該間接ELISA方法檢測已知的BTV陽性血清20份和陰性血清20份。

2 結(jié)果

2.1 重組桿狀病毒質(zhì)粒 Bacmid-NS3的構(gòu)建：通過亞克隆，將NS3序列插入至載體pFastBac-HTA，構(gòu)建重組質(zhì)粒pFastBac-HTA-NS3，并以雙酶切和菌落PCR進(jìn)行鑒定，鑒定結(jié)果見圖1，PCR和雙酶切均能得到700 bp左右的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。同時，經(jīng)全基因測序，確認(rèn)NS3序列完整、無堿基突變、且與載體上His標(biāo)簽處于同一ORF中。將測序正確的重組質(zhì)粒pFastBac-HTA-NS3轉(zhuǎn)化入DH10Bac，通過藍(lán)白斑、菌落PCR進(jìn)行篩選。以M13引物和NS3特異性引物進(jìn)行PCR鑒定重組桿狀病毒質(zhì)粒Bacmid-NS3，結(jié)果與預(yù)期一致。

圖1 pFastBac-HTA-NS3鑒定Fig.1 Identification of pFastBac-HTA-NS31：菌落PCR鑒定；2：酶切鑒定；M：DNA Marker (DL-5 000)1:Colony PCR;2:Double digests;M:DNA Marker (DL-5 000)

2.2 重組桿狀病毒rBac-NS3的獲得 轉(zhuǎn)染試劑盒將Bacmid-NS3轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48～72 h可以觀察到明顯的細(xì)胞病變：與正常Sf9細(xì)胞相比，細(xì)胞數(shù)量明顯變少，細(xì)胞變大且發(fā)生臌脹、變得容易脫落，并有少量細(xì)胞破碎，見中插彩版圖2。轉(zhuǎn)染后超過72 h，Sf9細(xì)胞大量破碎。

2.3 間接免疫熒光試驗(yàn) 通過間接免疫熒光檢測重組桿狀病毒rBac-NS3感染Sf9細(xì)胞后NS3蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果見中插彩版圖3，野生桿狀病毒(未插入目的基因)感染的Sf9細(xì)胞未觀察到任何特異性的綠色熒光，而重組桿狀病毒rBac-NS3感染的Sf9細(xì)胞顯示出強(qiáng)烈的綠色熒光。這一結(jié)果表明，重組桿狀病毒rBac-NS3感染的Sf9細(xì)胞能夠大量表達(dá)NS3蛋白。

2.4 NS3蛋白的SDS-PAGE與Western Blot分析 大量接毒Sf9細(xì)胞，72 h后收集細(xì)胞裂解上清。使用Ni-NTA Fast Start Kit試劑盒純化重組NS3蛋白。取少量純化產(chǎn)物和細(xì)胞裂解上清，進(jìn)行SDS-PAGE和Western Blot分析。分別用Anti-His單抗和BTV綿羊陽性血清進(jìn)行Western Blot分析，見圖4。結(jié)果顯示，在重組桿狀病毒rBac-NS3感染的Sf9細(xì)胞蛋白中，分別以Anti-His單抗和BTV綿羊陽性血清作為一抗，均可以檢測到大小約為28.5 kDa的特異性蛋白條帶，與預(yù)期NS3蛋白大小一致，而在野生桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞對照并無此條帶。這一結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了重組桿狀病毒rBac-NS3感染的Sf9細(xì)胞可表達(dá)BTV NS3蛋白。Ni-NTA Fast Start Kit試劑盒的純化產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果顯示(圖5)，在28.5 kDa左右有1條明顯的蛋白條帶，與預(yù)期的NS3蛋白大小(含His標(biāo)簽)一致。與此同時，分別以Anti-His單抗和BTV綿羊陽性血清作為一抗的Western Blot結(jié)果顯示，在同樣的位置檢測到明顯的蛋白條帶。這些結(jié)果表明，本試驗(yàn)成功地純化到具有反應(yīng)原性的BTV NS3蛋白。

圖4 NS3蛋白純化Western Blot結(jié)果Fig.4 Western Blot result of NS3 proteinA：Anti-His單抗Western Blot結(jié)果；B：綿羊藍(lán)舌病陽性血清Western Blot結(jié)果；M：蛋白Marker；1：野生桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞對照；2：重組桿狀病毒rBac-NS3感染的Sf9細(xì)胞；3：純化的NS3蛋白A:Western Blot with Anti-His McAb;B:Western Blot with BTV positive serum;M:Protein marker;1:Sf9 cells infected with wild baculovirus;2:Sf9 cells infected with rBac-NS3;3:The purified of NS3 protein

圖5 NS3蛋白表達(dá)純化SDS-PAGE結(jié)果Fig.5 SDS-PAGE result of NS3 protein1：NS3蛋白純化結(jié)果；2：重組桿狀病毒rBac-NS3感染的Sf9細(xì)胞；3：野生桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞對照；M：蛋白Marker1:The purified of NS3 protein;2:Sf9 cells infected with rBac-NS3;3:Sf9 cells infected with wild baculovirus;M:Protein Marker

2.5 間接ELISA方法驗(yàn)證NS3蛋白的免疫原性 為進(jìn)一步驗(yàn)證重組蛋白NS3的免疫原性，以純化的蛋白NS3為包被蛋白，初步建立一種間接ELISA，檢測已知的20份藍(lán)舌病陽性血清和20份藍(lán)舌病陰性血清。結(jié)果顯示，20份藍(lán)舌病陽性血清OD值均大于1.5，而20份藍(lán)舌病陰性血清OD值在0.3左右，兩者差異顯著，如圖6所示。這一結(jié)果表明，以純化的蛋白NS3為包被蛋白的間接ELISA可區(qū)分藍(lán)舌病陽性血清和陰性血清，進(jìn)一步驗(yàn)證了本試驗(yàn)純化獲得的重組蛋白NS3具有良好反應(yīng)原性。

圖6 間接ELISA結(jié)果Fig.6 The result of indirect-ELISA

3 討論

藍(lán)舌病作為一種反芻動物疫病，可給流行國家或地區(qū)帶來重大的經(jīng)濟(jì)損失。隨著全球氣候變暖，蟲媒活動范圍擴(kuò)大，BT的流行范圍也不斷擴(kuò)大。我國于1979年在云南發(fā)現(xiàn)并分離到BTV。迄今為止，我國共有31個省市地區(qū)發(fā)現(xiàn)此病，存在的血清型眾多，其中主要流行的血清型為1型和16型。鑒于其重大危害，預(yù)防和控制BT成為了世界各國重大動物疫病研究的熱點(diǎn)。

與原核表達(dá)系統(tǒng)相比，昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)能夠識別和處理信號肽，并且能夠在翻譯后實(shí)現(xiàn)如糖基化、酰化、磷酸化和二硫鍵的形成等修飾，從而確保目的蛋白結(jié)構(gòu)與功能的完整性[10-11]。同時考慮到BTV屬于蟲媒病毒，可在昆蟲細(xì)胞中復(fù)制，并且NS3蛋白本身在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于哺乳動物細(xì)胞。為此，本試驗(yàn)選用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)對NS3進(jìn)行表達(dá)，以期獲得具有天然結(jié)構(gòu)和功能的NS3蛋白。本試驗(yàn)用Bac-to-Bac昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)BTV8 NS3蛋白的可溶表達(dá)，并利用His標(biāo)簽成功純化到NS3蛋白。本試驗(yàn)通過間接免疫熒光檢測到，感染了重組桿狀病毒rBac-NS3的Sf9細(xì)胞可以大量表達(dá)NS3蛋白；SDS-PAGE結(jié)果、分別以Anti-His單抗和BTV綿羊陽性血清作為一抗的Western Blot結(jié)果均表明，本試驗(yàn)成功純化到了具有免疫活性的NS3蛋白；以純化的蛋白為包被抗原初步建立的間接ELISA方法，可明顯區(qū)分BTV陽性血清和陰性血清，進(jìn)一步說明本試驗(yàn)純化的NS3蛋白具有良好的反應(yīng)活性。

BTV NS3蛋白可作為一種診斷抗原用于鑒別診斷藍(lán)舌病野毒感染和疫苗接種[12]。而且，隨著研究的不斷深入，人們對NS3蛋白功能的認(rèn)識不斷更新。研究者發(fā)現(xiàn)，NS3蛋白可以通過MAPK/ERK通路影響病毒的復(fù)制，其2個多堿基元件(Polybasic motifs)在BTV的突變和病毒粒子釋放中有著關(guān)鍵作用，細(xì)小的改變均會影響病毒的擴(kuò)增和擴(kuò)散[13-16]。本試驗(yàn)利用Bac-to-Bac昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了BTV8 NS3蛋白的可溶表達(dá)，并利用His標(biāo)簽成功純化到具有良好的反應(yīng)原性的NS3蛋白，為BTV NS3蛋白功能的進(jìn)一步研究以及鑒別診斷試劑盒的研制提供理論基礎(chǔ)。