夏 天 馬晴晴 李小月 徐元宏 鄭美娟

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，合肥 230022)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是嗜肝DNA病毒科成員，可導(dǎo)致慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)、肝硬化(liver cirrhosis，LC)，甚至肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。雖然嗜肝性病原體如HBV感染可誘導(dǎo)肝臟免疫耐受，但肝臟耐受介導(dǎo)CHB進(jìn)展至LC和HCC的原因尚未闡明。

調(diào)節(jié)性T(regulatory T cell，Treg)細(xì)胞表達(dá)CD4、CD25和Foxp3，通過細(xì)胞接觸或分泌免疫抑制性細(xì)胞因子抑制免疫效應(yīng)細(xì)胞活性，介導(dǎo)負(fù)向免疫調(diào)控[2]。IL-10可介導(dǎo)抗病毒免疫應(yīng)答的抑制作用，參與CHB發(fā)病[3]。研究表明IL-10可由 Treg、樹突狀細(xì)胞、骨髓來源的抑制性細(xì)胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)及Kupffer cell等分泌[4-6]。Treg與CHB患者外周血病毒載量及HBeAg有關(guān)，提示CHB患者 Treg細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子在HBV感染中起重要作用[7]。

NK細(xì)胞是固有免疫系統(tǒng)的重要成員，亦是機(jī)體抗感染和抗腫瘤免疫的第一道天然防線，無需抗原的預(yù)先刺激即可直接殺傷被病毒感染的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞。本團(tuán)隊前期研究發(fā)現(xiàn)，急性HBV感染NK細(xì)胞分泌的IFN-γ參與HBV清除，而CHB患者IL-10與NK細(xì)胞高表達(dá)抑制性受體NKG2A密切相關(guān)[8，9]。而CHB、LC和HCC患者NK細(xì)胞功能與Treg誘導(dǎo)的肝臟免疫耐受的關(guān)系尚不清楚。因此，本文擬探討HBV持續(xù)感染導(dǎo)致的CHB、LC及HCC患者NK細(xì)胞及IFN-γ+NK細(xì)胞與Treg及IL-10的相關(guān)性闡明，以期為HBV慢性感染及其進(jìn)展疾病的發(fā)病機(jī)制及臨床治療提供理論支持。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象 選取安慶市第一人民醫(yī)院HBV相關(guān)肝病患者119例，其中CHB患者57例，LC患者40例， HCC患者22例。健康對照組(health controls,HC)選擇我院性別、年齡相匹配的體檢健康者27例。CHB、LC、HCC診斷分別符合《慢性乙型肝炎防治指南 2010年更新版》和《原發(fā)性肝癌診斷標(biāo)準(zhǔn)》，并排除HAV、HCV、HEV、HIV和其他嗜肝病毒感染，同時排除自身免疫性疾病等導(dǎo)致的肝損害及肝臟以外的惡性腫瘤。本實驗通過本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有參檢者知情同意。

1.1.2主要儀器和試劑 FACS Calibur型流式細(xì)胞儀、FACS CANTO Ⅱ PLUS型流式細(xì)胞儀、抗CD25-FITC、抗CD4-PE、溶血素、CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit 、BD MultiTEST IMK Kit均購自美國BD公司；抗Foxp3-APC內(nèi)標(biāo)染色試劑盒購自美國eBioscience公司；PMA、MON及ION購自Sigma公司；7600型自動生化分析儀購自HITACHI公司。

1.2方法

1.2.1Treg的檢測 取新鮮(<24 h)采集的EDTA抗凝全血標(biāo)本100 μl，加入抗CD25-FITC、抗CD4-PE，避光孵育15 min，加1 ml溶血素，混勻，避光15 min，1 500 r/min離心5 min，棄上清，1 ml PBS洗滌，加入固定穿膜液4℃避光60 min，Buffer洗滌2次，棄上清，加Foxp3-APC，避光60 min，PBS洗滌2次，棄上清，加200 μl PBS，F(xiàn)ACS Calibur型流式細(xì)胞儀檢測，DIVA軟件分析CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞比例。

1.2.2Th1/Th2細(xì)胞因子檢測 按照需要檢測的樣本數(shù)量配制Mixbead，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加等體積Serum Enhancement Buffer，輕輕混勻后避光30 min；倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，得到原液、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256，9個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。取流式管，每管加50 μl Mixbead，繼續(xù)加入50 μl血清或標(biāo)準(zhǔn)品，再加入50 μl抗體，振蕩，避光孵育3 h，加1 ml PBS，1 500 r/min離心5 min，棄上清，加300 μl PBS，F(xiàn)ACS Calibur型流式細(xì)胞儀檢測，DIVA軟件和OriginPro軟件分析細(xì)胞因子濃度。

1.2.3外周血淋巴細(xì)胞亞群(CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞)檢測 取2支流式管，分別編號A1、A2，A1管加入CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PreCP/CD4-APC抗體20 μl，A2管加入CD3-FITC/CD16+CD56+-PE/CD45-PreCP/CD19-APC抗體20 μl，新鮮(<24 h)采集的EDTA抗凝全血標(biāo)本各100 μl分別加入A1、A2管，混勻，避光孵育15 min，加入FACS Lysing溶血液2 ml，室溫避光孵育10 min。1 500 r/min離心5 min，棄上清，PBS洗滌細(xì)胞2次，重復(fù)離心棄上清，加入PBS 500 μl，F(xiàn)ACS Calibur型流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.4IFN-γ+NK細(xì)胞檢測 分離PBMC，配制含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基、50 ng/ml PMA，2 mg/ml MON及500 ng/ml ION，將細(xì)胞加入1 ml培養(yǎng)基，刺激細(xì)胞后，加入表面標(biāo)記NK細(xì)胞，固定外標(biāo)后的細(xì)胞40 min，加穿膜液破膜，加入5 μl FITC-IFN-γ，4℃避光孵育60 min，加入1 ml PBS，棄上清，200 μl PBS重懸，F(xiàn)ACS CANTO Ⅱ PLUS型流式細(xì)胞儀檢測。

2 結(jié)果

2.1患者臨床資料 與HC組相比，CHB、LC、HCC組患者ALT、AST均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組臨床資料

2.2各組外周血Treg及細(xì)胞因子水平 外周血Treg的比例為CD4+CD25+Foxp3+Treg占CD4+T細(xì)胞的百分比。研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，CHB、LC、HCC組外周血Treg百分比分別顯著升高(P<0.01)；CHB、HCC組外周血Treg計數(shù)分別為(29.53±13.33)個/μl 和30.47(21.99，46.03)個/μl，顯著高于健康對照組(22.43±11.26)個/μl，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。CHB、LC及HCC組血清IL-10含量分別為1.56(1.22，2.63)pg/ml、1.94(1.30，3.30)pg/ml、2.81(1.91，3.63)pg/ml，均顯著高于HC組的1.21(1.05，1.46)pg/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果見圖1、表2。在CHB組中，Treg和IL-10正相關(guān)(P<0.01，r=0.564)，和IFN-γ有一定程度上的負(fù)相關(guān)(P<0.01，r=-0.342)；LC組Treg和IL-10正相關(guān)(P<0.01，r=0.426)；HCC組Treg和IL-10正相關(guān)(P<0.05，r=0.476)。

表2 各組外周血細(xì)胞因子水平

2.3各組外周血中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞變化 NK細(xì)胞在CHB、LC及HCC組中顯著低于HC組；除NK細(xì)胞外， LC組中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞與HC組相比，HCC組中CD8+T淋巴細(xì)胞與HC組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。見表3。

表3 各組外周血中CD3+ T、CD4+ T、CD8+T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞的水平比較

2.4比較CHB、LC、HCC患者及健康對照者外周血IFN-γ+NK細(xì)胞的百分比及血清IFN-γ含量 CHB、LC及HCC組的IFN-γ+NK細(xì)胞比例分別為(76.18±6.79)%、(36.92±26.41)%及(35.03±21.31)%，均顯著低于HC組。CHB、LC、HCC組血清IFN-γ含量分別為0(0，1.47)pg/ml、0(0，1.57)pg/ml、0.55(0，1.57)pg/ml，均低于HC組，見圖2。

圖2 比較CHB、LC及HCC患者與HC組外周血IFN-γ+NK細(xì)胞的百分比及血清IFN-γ含量Fig.2 Comparison of percentages of IFN-γ+NK cells in peripheral blood and serum IFN-γ concentration among patients from CHB，LC and HCC and healthy controls

2.5CHB、LC及HCC患者外周血IFN-γ+NK細(xì)胞比例/NK細(xì)胞計數(shù)與Treg比例、IL-10水平的相關(guān)性分析 結(jié)果表明CHB患者組IFN-γ+NK比例與Treg比例、血清IL-10水平均負(fù)相關(guān)(P<0.05，r=-0.618；P<0.05，r=-0.635)，血清IFN-γ水平亦與Treg細(xì)胞比例負(fù)相關(guān)(P<0.01，r=-0.342)； LC患者外周血中NK細(xì)胞計數(shù)與Treg的比例負(fù)相關(guān)(P<0.05，r=-0.317)，IFN-γ+NK細(xì)胞比例與血清中IL-10水平負(fù)相關(guān)(P<0.05，r=-0.514)。HCC患者組IFN-γ+NK細(xì)胞比例與Treg細(xì)胞比例、IL-10水平均負(fù)相關(guān)(P<0.01，r=-0.676；P<0.01，r=-0.615)。見圖3。

圖3 CHB、LC及HCC患者外周血IFN-γ+NK細(xì)胞比例/NK細(xì)胞計數(shù)與Treg細(xì)胞比例IL-10水平的相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis of the ratio of IFN-γ+NK cells/NK cell count with Treg cell ratio and IL-10 level in peripheral blood of patients with CHB, LC and HCCNote:A，B.Correlation analysis of IFN-γ+NK cell percentages with frequencies of Treg in peripheral blood and serum IL-10 level in CHB patients；C,D.correlation analysis between number of NK cells and percentages of Tregs in peripheral blood，percentages of IFN-γ+NK cells and the level of IL-10 in serum of LC patients;E,F.Correlation analysis of frequencies of IFN-γ+NK cells with Tregs in peripheral blood and serum IL-10 level in HCC patients.

3 討論

Treg介導(dǎo)的免疫抑制效應(yīng)可能是CHB發(fā)展的原因之一[10]。Treg約占正常人CD4+T細(xì)胞的5%～10%，具有免疫抑制功能，其重要表型為CD4+CD25+Foxp3+，最特異的標(biāo)記之一是叉頭轉(zhuǎn)錄因子Foxp3[11]。本研究發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞比例在CHB、LC、HCC患者外周血中明顯高于HC組，與既往研究結(jié)論一致[12]。慢性HBV感染中，Tregs隨HBV抗原負(fù)載增加而增加，且作為HBV的避難所，可避免免疫攻擊，減輕肝臟損傷[13]。肝癌通常在慢性肝炎和肝硬化的環(huán)境下發(fā)展，Tregs可能通過抑制免疫應(yīng)答(如HBV)或控制腫瘤生長(如肝癌)促進(jìn)持續(xù)性感染。Fu等[12]認(rèn)為外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg在數(shù)值上與疾病進(jìn)展相關(guān)，可被認(rèn)為是肝癌患者生存不良的預(yù)測因子，且Treg增加抑制CD4+輔助性T細(xì)胞反應(yīng)，并促進(jìn)肝癌進(jìn)展。以上結(jié)果表明，HBV可能增強(qiáng)Treg的誘導(dǎo)。慢性HBV感染加上長期復(fù)發(fā)的免疫介導(dǎo)的肝損傷有助于LC和HCC發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)Treg計數(shù)在CHB和HCC組高于HC組(P<0.05)，而LC組Treg計數(shù)與HC組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究中，Treg計數(shù)通過血常規(guī)淋巴細(xì)胞計數(shù)×CD4+T%×Treg%得出，LC患者常伴有脾功能亢進(jìn)，而脾功能亢進(jìn)可引起外周血3系降低，淋巴細(xì)胞計數(shù)降低，可能是導(dǎo)致Treg計數(shù)在LC組和HC組中差異無統(tǒng)計學(xué)意義的原因。

Th1型相關(guān)細(xì)胞因子(如IL-2、TNF、IFN-γ)和Th2型相關(guān)細(xì)胞因子(如IL-4、IL-5、IL-10)是細(xì)胞因子的兩大類。Th1型細(xì)胞因子介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，而Th2型細(xì)胞因子主要介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。由于細(xì)胞因子與HBV感染后炎癥發(fā)生密切相關(guān)，本研究檢測了Th1和Th2細(xì)胞因子在HBV感染疾病中的分泌水平。抑制性細(xì)胞因子IL-10可介導(dǎo)Treg的抑制功能，其可通過誘導(dǎo)肝臟耐受抑制肝臟炎癥損傷[14，15]。研究發(fā)現(xiàn)IL-10在CHB、LC、HCC患者外周血中明顯高于HC組，與Zekri等[16]的結(jié)論一致。研究表明IL-10表達(dá)增加是導(dǎo)致慢性HBV感染的主要因素[17]。IL-10可抑制宿主的抗HBV活性，導(dǎo)致體內(nèi)HBV持續(xù)復(fù)制和表達(dá)。IL-10水平的升高與HBV血清滴度和肝臟炎癥程度有關(guān)，且介導(dǎo)纖維化進(jìn)程及疾病進(jìn)展[18]。CHB患者中，Treg和IL-10呈正相關(guān)，和IFN-γ存在一定程度的負(fù)相關(guān)，在LC和HCC中，Treg和IL-10亦呈正相關(guān)，可能由于HBV的存在增強(qiáng)Foxp3的表達(dá)和Treg細(xì)胞誘導(dǎo)作用[19]。Treg產(chǎn)生IL-10， IL-10不僅抑制Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)，還可抑制Th1型細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ等[20]。研究表明，CD4+CD25+T細(xì)胞促進(jìn)慢性HBV感染者免疫反應(yīng)受損，劑量依賴性地抑制對HBcAg特異性的IFN-γ產(chǎn)生，還能抑制HBV特異性CD8+T細(xì)胞的增殖和IFN-γ的產(chǎn)生[21，22]。IFN-γ主要由活化T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，而IL-10可通過抑制NK細(xì)胞活性抑制IFN-γ[23]。

HBV感染期間，NK細(xì)胞作為宿主抵抗病毒感染和腫瘤的第一道防線在抗病毒免疫中發(fā)揮重要作用[24]。NK細(xì)胞表達(dá)大量的免疫識別受體(NK受體)，維持NK細(xì)胞免疫應(yīng)答和免疫耐受平衡。NK細(xì)胞受體的異常表達(dá)和肝臟NK細(xì)胞的功能障礙是導(dǎo)致慢性HBV感染和HCC的原因，且與肝癌預(yù)后不良顯著相關(guān)。腫瘤免疫細(xì)胞在宿主免疫防御及腫瘤進(jìn)展中起重要作用。以NK細(xì)胞受體-配體系統(tǒng)為靶點的新藥和聯(lián)合治療策略可能對肝癌的免疫治療起積極作用[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，在CHB、LC和HCC組中，NK細(xì)胞降低(P<0.01)，與Li等[26]研究結(jié)果一致。

Yang等[27]觀察到HBV成分進(jìn)入NK細(xì)胞，部分通過抑制核因子κB(NF-κB)和p38有絲分裂原激活蛋白激酶(MAPK)信號通路導(dǎo)致NK細(xì)胞功能障礙、細(xì)胞毒性和IFN-γ分泌降低。與本研究結(jié)果一致，IFN-γ水平在CHB、LC、HCC組有不同程度降低，可能是由于IFN-γ除NK T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和Th1細(xì)胞外，還可由NK細(xì)胞產(chǎn)生[28]。本研究發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞在CHB、LC和HCC組中降低，為進(jìn)一步證實，實驗人員隨機(jī)抽取一部分CHB、LC、HCC患者和HC組標(biāo)本，檢測各組外周血NK細(xì)胞表達(dá)的IFN-γ占NK細(xì)胞的百分比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與HC組相比，CHB、LC和HCC組IFN-γ+NK細(xì)胞的百分比降低(P<0.01)，與Zhang等[29]的meta分析結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)在HBV進(jìn)展中，CHB、HCC患者組IFN-γ+NK細(xì)胞比例與Treg細(xì)胞比例、IL-10水平均呈負(fù)相關(guān)；LC患者外周血NK細(xì)胞計數(shù)與Treg細(xì)胞比例呈負(fù)相關(guān)，IFN-γ+NK細(xì)胞比例與血清IL-10水平呈負(fù)相關(guān)，是因為Tregs參與慢性炎癥發(fā)生和腫瘤進(jìn)展，且可抑制NK細(xì)胞[30]。此外，Treg通過分泌免疫抑制性細(xì)胞因子IL-10，引起NK細(xì)胞減少，從而產(chǎn)生耐受性和抑制性環(huán)境[31]。在CHB中，高水平IL-10產(chǎn)生可能參與抑制NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ[32]。CD4+CD25+Tregs以細(xì)胞接觸的方式直接抑制NK細(xì)胞的肝細(xì)胞毒性，對于揭示HBV相關(guān)肝病的免疫損傷機(jī)制和調(diào)節(jié)機(jī)制至關(guān)重要，Tregs的免疫抑制作用可能用于治療慢性乙肝病毒感染[33]。

本研究探討了HBV患者疾病進(jìn)展過程中NK細(xì)胞與Treg及細(xì)胞因子的關(guān)系，通過檢測HBV進(jìn)展過程中患者外周血NK細(xì)胞計數(shù)、IFN-γ+NK細(xì)胞比例、Treg百分比及計數(shù)及細(xì)胞因子濃度，闡述IFN-γ+NK細(xì)胞與Treg分泌的IL-10之間的關(guān)系，以期為了解乙型肝炎的發(fā)病機(jī)制及進(jìn)展提供理論支持。研究表明NK細(xì)胞的功能缺陷在接受抗病毒治療的CHB患者中持續(xù)存在，但可通過特異性阻斷IL-10在體外逆轉(zhuǎn)[34]。近年NK細(xì)胞在肝纖維化中的作用受到廣泛關(guān)注，提示NK細(xì)胞有望成為肝纖維化治療的重要靶細(xì)胞和腫瘤治療的免疫靶點[35，36]。免疫療法正迅速發(fā)展為除外科、化學(xué)療法、放射療法和靶向治療外癌癥治療外的“第五支柱”。嵌合抗原受體(CAR)工程免疫細(xì)胞是腫瘤免疫治療中的具有廣泛前景的分支[37]。由于NK細(xì)胞不需要嚴(yán)格的HLA匹配，也不存在移植物抗宿主疾病的風(fēng)險，因此CAR-NK細(xì)胞療法比傳統(tǒng)的CAR-T細(xì)胞療法更安全。本研究結(jié)果及本領(lǐng)域的其他研究進(jìn)展提示或許可通過阻斷Treg或者IL-10恢復(fù)NK細(xì)胞功能，為CHB感染者提供有效治療；或者聯(lián)合CAR-NK細(xì)胞療法抑制HBV復(fù)制，阻止HBV的惡性進(jìn)展，以上方式有望在HBV治療中發(fā)揮作用[16，37，38]。