谷嬉嬉 楊 峻 何永玲 石 祥 韋葉生

(桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗科，桂林 541001)

缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factors,HIFs)在生物體中參與多種生理病理過程，在糖酵解、血管生成、細(xì)胞分化、凋亡等細(xì)胞通路中發(fā)揮重要作用，是一種在缺氧條件下能夠幸存的重要的異二聚體轉(zhuǎn)錄因子[1]。HIFs作為一種基本的螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子，由3個α亞基和1個β亞基組成，HIF-α蛋白家族成員為HIF-1α、HIF-2α及HIF3A[2，3]。HIF-α是氧調(diào)節(jié)亞基，正常生理條件下可被脯氨酸羥化酶(PHD)家族羥基化，導(dǎo)致HIF蛋白降解，缺氧條件下，PHD活性降低，HIF蛋白亞基積累，激活缺氧反應(yīng)基因[4，5]。HIFs家族成員結(jié)構(gòu)和調(diào)控機(jī)制的研究多集中于HIF-1α和HIF-2α，對HIF3A的研究較少。1998年在小鼠體內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)HIF3A，對低氧基因誘導(dǎo)產(chǎn)生負(fù)性調(diào)控作用[6,7]。HIF3A過表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，抑制細(xì)胞凋亡。近期研究發(fā)現(xiàn)，HIF3A與多種疾病狀態(tài)和環(huán)境暴露有關(guān)，但關(guān)于HIF3A基因rs3764609A/G和rs376411T/C遺傳多態(tài)性的研究在國內(nèi)外尚未見報道。因此，本研究采用SNPscan技術(shù)對廣西健康人群HIF3A基因rs3764609A/G和rs3764611T/C基因位點進(jìn)行基因分型檢測，探討其在不同人群間的分布差異，為HIF3A基因相關(guān)疾病和群體遺傳學(xué)研究提供參考，豐富廣西人群基因數(shù)據(jù)庫。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對象 隨機(jī)選取2018年5月至2019年6月到我院體檢的健康志愿者187例，其中男性107例，女性80例，年齡21～79歲。排除自身免疫性疾病、心血管、腦血管和器質(zhì)性疾病，各臨床檢查及實驗室指標(biāo)正常，均為健康無親緣關(guān)系的獨立個體。本研究在我院倫理委員會批準(zhǔn)下進(jìn)行，所有志愿者知情同意。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取 EDTA-K2紫色抗凝管收集各受試者晨起空腹靜脈血3.0 ml，離心柱法提取基因組DNA，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物的設(shè)計與合成 登錄NCBI查詢HIF3α基因rs3764609A/G和rs3764611T/C序列，primer3軟件輔助設(shè)計引物序列(表1)，由上海天昊生物科技有限公司合成。

表1 HIF3-α基因rs3764609A/G和rs3764611T/C連接引物

1.2.3連接和多重PCR反應(yīng)及基因分型檢測 連接反應(yīng)體系總體積20.0 μl，其中樣本DNA 8.0 μl，2×連接緩沖液10.0 μl，耐熱DNA連接酶0.2 μl，連接探針混合液0.8 μl，剩余體積用滅菌雙蒸水補(bǔ)足。連接反應(yīng)參數(shù)：98℃ 2 min，95℃ 30 s，58℃ 3 h，循環(huán)5次，94℃ 2 min，72℃ forever。連接產(chǎn)物進(jìn)行多重?zé)晒釶CR擴(kuò)增，反應(yīng)體系總體積20 μl，其中連接產(chǎn)物1.0 μl，2×PCR緩沖液A 10.0 μl，Taq DNA聚合酶0.4 μl，多重?zé)晒鈹U(kuò)增引物0.5 μl，滅菌雙蒸水8.1 μl。多重PCR反應(yīng)參數(shù)：95℃ 2 min，94℃ 20 s，62℃ 40 s(每個循環(huán)降低0.5℃)，72℃ 1.5 min，循環(huán)9次，94℃ 20 s，57℃ 40 s，72℃ 1.5 min，循環(huán)25次；68℃ 60 min；4℃ forever。將多重PCR產(chǎn)物10倍ddH2O稀釋，振蕩混勻，取1.0 μl PCR產(chǎn)物與0.1 μl LIZ500+8.9 μl Hi-Di混勻，95℃變性5 min后ABI3500測序儀檢測，GeneMapper 4.1軟件分析原始數(shù)據(jù)。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，直接計算基因型和等位基因頻率，Hardy-Weinberg遺傳平衡(HWE)定律檢驗樣本群體代表性，HWE采用χ2檢驗。廣西健康人群兩位點與HapMap公布的不同地區(qū)人群的基因型和等位基因型比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1HIF3A基因rs3764609A/G和rs3764611T/C分型檢測結(jié)果 兩位點的基因型分布均符合HWE定律，表明選取的人群具有代表性。分型結(jié)果顯示rs3764609A/G位點存在GG、AG和AA 3種基因型，頻率分別為14.4%、53.5%和32.1%，G、A等位基因頻率分別為41.0%和59.0%。rs3764611T/C位點存在CC、CT和TT 3種基因型，頻率分別為16.0%、47.6%和36.4%，C、T等位基因頻率分別為39.8%和60.2%。基因分型結(jié)果見圖1。

圖1 熒光毛細(xì)管電泳基因分型圖Fig.1 Genetic typing map of fluorescent capillary electrophoresisNote:A.rs3764609A/G;B.rs3764611T/C.

2.2廣西人群HIF3A基因rs3764609A/G和rs3764611T/C位點多態(tài)性在不同性別間的分布 廣西人群HIF3A基因rs3764609A/G和rs3764611/C分別以AG(53.5%)和CT(47.6%)基因型多見，其次為AA(32.1%)和TT(36.4%)；A和T等位基因頻率最高，分別為59.0%和60.2%。兩位點的基因型和等位基因頻率在性別間的分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 廣西人群基因HIF3A位點rs3764609A/G和rs3764611T/C基因型和等位基因頻率分布

2.3HIF3A基因rs3764609A/G和rs3764611T/C多態(tài)性與各人群比較 廣西人群的rs3764609A/G和rs3764611T/C基因型和等位基因頻率與HapMap公布的CEU、JPT和YRI人群差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，基因型頻率與HCB人群差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),但等位基因頻率與HCB人群差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表3、4。

表3 廣西人群HIF3A基因rs3764609A/G基因型和等位基因頻率與不同人群的比較

表4 廣西人群HIF3A基因rs3764611C/T基因型和等位基因頻率與不同人群的比較

3 討論

HIF3A作為HIFs家族成員，其基因位于人類19號染色體q13.32區(qū)域,包括18個外顯子。HIF3A獨特的結(jié)構(gòu)特征包括在氧依賴降解域 (ODDD)中存在1個羥基化的脯氨酸，在分子的C端存在1個取代C端反式激活域(CTAD)的亮氨酸拉鏈(LZIP)，參與蛋白質(zhì)相互作用[8]。HIF3A基因經(jīng)歷復(fù)雜的調(diào)控，產(chǎn)生大量mRNA剪接體，并被翻譯為不同的多肽,廣泛表達(dá)于胎盤、脾臟等17個組織。HIFs家族中，HIF-1α和HIF-2α為轉(zhuǎn)錄激活因子，而HIF3A則為負(fù)性調(diào)控因子，抑制HIF-1α和HIF-2α在低氧狀態(tài)下的基因表達(dá)[9]。國內(nèi)外學(xué)者對HIFs的研究主要集中于HIF-1和HIF-2，由于HIF3A存在剪變體多樣性，結(jié)構(gòu)相對復(fù)雜，因此，針對HIF3A的位點研究相對較少。近年HIF3A基因與疾病的關(guān)系引起研究者廣泛關(guān)注，成為基因研究的新興領(lǐng)域。人類基因組計劃掃描發(fā)現(xiàn)，HIF3A存在多個單核苷酸多態(tài)性(SNPs)位點，其多態(tài)性改變可能引發(fā)HIF3A基因相關(guān)疾病遺傳易感性，但仍處研究階段。Zhou等[9]研究發(fā)現(xiàn)，HIF3A在胰腺癌組織中表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的入侵和轉(zhuǎn)移，為胰腺癌的分子機(jī)制和治療方案研究提供新思路。rs12593988位點多態(tài)性與結(jié)直腸癌的發(fā)生有關(guān)，但尚無確切證據(jù)表明HIFs多態(tài)性和結(jié)直腸癌有關(guān)[10]。研究表明HIF3A基因的改變與前列腺腫瘤、嬰幼兒超重有關(guān)[11]。Wang等[12]發(fā)現(xiàn)HIF3A rs3826795 G-allele與肥胖兒童血漿ALT升高呈正相關(guān)，但在正常人群中與血漿ALT含量不相關(guān)。在不同非軟骨細(xì)胞中，關(guān)于缺氧是否上調(diào)HIF3A尚未見報道。Markway等[13]發(fā)現(xiàn)，急性和慢性缺氧均下調(diào)健康人軟骨細(xì)胞再分化過程中的HIF3A水平，并證實HIF3A表達(dá)是人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞表型的特征。此不一致現(xiàn)象可能與低氧濃度不一致有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)在妊娠期糖尿病(GDM)患者中，HIF3A表達(dá)下調(diào)，但HIF-1α和HIF-2α表達(dá)無變化[14]。HIF3A啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)與GDM高度相關(guān)，可能成為GDM治療的新靶點。HIF3A基因與腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性仍處于探索階段，但近期研究發(fā)現(xiàn)HIF3A參與調(diào)控肝癌的生物鐘，其過表達(dá)會加快腫瘤細(xì)胞生長繁殖，提示HIF3A參與人體生理和病理過程[15]。

SNPs是人類基因組中最常見的變異，是疾病/癌癥預(yù)測和治療評價的常用生物標(biāo)志物。SNPs主要是在基因水平上由單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，其基因在某一位點突變率大于1%。目前，對于HIF3A基因SNPs的研究較少，而廣西人群rs3764609A/G和rs3764611T/C多態(tài)性研究尚未見報道。本研究采用高通量SNPscan技術(shù)檢測廣西人群HIF3A基因rs3764609A/G和rs376411T/C位點多態(tài)性，并將檢測結(jié)果與HapMap公布的CEU、JPT、YRI和HCB 4個人群的結(jié)果進(jìn)行比較，分析其與不同地區(qū)和不同種族人群的差異。結(jié)果顯示，廣西人群HIF3A基因rs3764609A/G和rs3764611T/C位點基因型和等位基因頻率分布在不同性別間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明這2個位點多態(tài)性在同一人群中與性別無關(guān)。進(jìn)一步將廣西人群HIF3A基因rs3764609A/G和rs376411T/C位點多態(tài)性與HapMap數(shù)據(jù)庫公布的4個人群的SNP分型數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)廣西人群rs3764609位點基因型和等位基因頻率與CEU、JPT和YRI人群差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，而與HCB人群相比，基因型差異有統(tǒng)計學(xué)意義，等位基因差異無統(tǒng)計學(xué)意義；廣西人群rs3764611T/C位點基因型和等位基因與CEU、JPT和YRI人群比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，與HCB人群相相比，基因型差異有統(tǒng)計學(xué)意義，等位基因差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

本研究結(jié)果提示，相同SNP位點其基因型和等位基因頻率分布在不同地區(qū)和種族間存在較大差異，可能是不同種族和地區(qū)的基因遺傳背景不同，且飲食、地理位置和環(huán)境存在差異所致。通過HIF-α兩位點多態(tài)性與HapMap中4個人群的比較發(fā)現(xiàn)，rs3764609A/G和rs3764611T/C的基因型和等位基因頻率與CEU和YRI相比差異最大，JPT次之，與HCB相比差異最小，且等位基因頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。不同地區(qū)和種族間除習(xí)俗、文化等方面有明顯差異外，其遺傳特性也存在差異。本研究體現(xiàn)了SNPs與親緣關(guān)系有關(guān)，廣西位于中國西南部，地理位置獨特，人口多為黃種人，歐洲和非洲人口多為白種人和黑種人，廣西人群與歐洲和非洲親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，多態(tài)性差異大，體現(xiàn)了SNP在不同種族間存在差異[16]。廣西，北京和日本同位于亞洲，多態(tài)性差異相對較小，由于生活水平提高、人口遷移及飲食習(xí)慣改變，北京和廣西人口存在同源性，因此SNPs小寫差異較小。

綜上所述，隨著科技迅速發(fā)展，對多態(tài)性的認(rèn)識越來越廣泛，基因多態(tài)性研究由全球具體到國家、省份，極大豐富了NCBI下SNPs數(shù)據(jù)庫信息。研究廣西人群HIF3A基因rs3764609A/G和rs3764611T/C位點多態(tài)性，并與HapMap公布的不同地區(qū)人群作比較，不僅豐富了HIF3A基因多態(tài)性的數(shù)據(jù)資料，也為相關(guān)疾病的防治奠定了遺傳學(xué)基礎(chǔ)。