宿世瓊 倪 青 侯 凈 王 舒 陳 歡

(貴州省人民醫(yī)院乳腺外科，貴陽 550002)

miRNA為非編碼小RNA，長(zhǎng)度約19～22 nt，可結(jié)合靶基因mRNA 3′端非編碼區(qū)調(diào)控靶基因表達(dá)，為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因，在腫瘤形成及細(xì)胞增殖、分化、凋亡、侵襲、遷移等過程中發(fā)揮重要作用，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮癌基因或抑癌基因作用。乳腺癌細(xì)胞中多種miRNA存在異常表達(dá)，參與乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲遷移[1]。miR-194為miRNA家族成員，參與多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[2,3]。Wnt/β-catenin通路參與細(xì)胞分化、增殖，乳腺癌細(xì)胞中存在Wnt/β-catenin通路異常，參與乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲遷移[4]。本文對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7中miR-194水平及其對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲遷移和Wnt/β-catenin信號(hào)的影響進(jìn)行研究，探討miR-194對(duì)乳腺癌的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞、人正常乳腺Hs578Bst細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫)，兔抗人GSK-3β單克隆抗體、兔抗人p-GSK-3β單克隆抗體、兔抗人β-catenin單克隆抗體、兔抗人cyclin-D1單克隆抗體、兔抗人C-Myc單克隆抗體、兔抗人MMP-7單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、RT-PCR試劑盒、Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)BPB公司)，脂質(zhì)體Lipofectamine 2000、MTT試劑、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Sigma公司)，miR-194 mimic和陰性對(duì)照(上海生工生物工程有限公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將MCF-7細(xì)胞和Hs578Bst細(xì)胞置于RPMI1640(胎牛血清和青霉素-鏈霉素)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞融合達(dá)90%、呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)時(shí)進(jìn)行傳代。

1.2.2RT-PCR測(cè)定miR-194水平 將MCF-7細(xì)胞和Hs578Bst細(xì)胞加入Trizol裂解5 min，提取總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-PCR測(cè)定MCF-7細(xì)胞和Hs578Bst細(xì)胞中miR-194水平，反應(yīng)條件為95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，共42個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參。miR-194水平以2-ΔΔCt表示。

1.2.3MCF-7細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 MCF-7細(xì)胞分為空白對(duì)照組(Blank組)、陰性對(duì)照組(NC組)和miR-194組。將miR-125b mimic及相應(yīng)的NC置于EP管，加入NBase-free water 1 000 μl，分裝備用。將各組MCF-7細(xì)胞接種于24孔板(1×105個(gè)/孔)，每組設(shè)置7個(gè)復(fù)孔，無抗生素培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，miR-194組加入miR-125b mimic，NC組加入NC存儲(chǔ)液，Blank組不轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)24 h，RT-PCR測(cè)定各組MCF-7細(xì)胞中miR-194水平，方法同1.2.2。

1.2.4MTT法測(cè)定MCF-7細(xì)胞增殖活性 取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞加入胰蛋白酶消化細(xì)胞，調(diào)整各組細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/ml，接種于96孔板，每組設(shè)置7個(gè)復(fù)孔，24、48、72 h在每孔中加入20 μl MTT，孵育4 h，取上清，加入DMSO溶液混勻，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(OD)值。

1.2.5Transwell小室測(cè)定MCF-7細(xì)胞侵襲能力 將Matrigel基質(zhì)膠用DMEM培養(yǎng)基(無血清、無雙抗)按1∶8比例稀釋，均勻包被Transwell小室底部培養(yǎng)1 h，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的MCF-7細(xì)胞饑餓培養(yǎng)2 h取出，上室中加入不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，下室加入含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基孵育1 h。收集MCF-7細(xì)胞，調(diào)整濃度為2×105個(gè)/ml，取100 μl加入Transwell小室上室，將含F(xiàn)BS的培養(yǎng)液加入下室，孵育4 h，PBS洗滌小室上層膜，甲醛固定，結(jié)晶紫染色，棉簽擦去附著細(xì)胞，觀察MCF-7細(xì)胞侵襲情況。

1.2.6劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定MCF-7細(xì)胞遷移能力 取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)MCF-7細(xì)胞接種于6孔板，4×105個(gè)/孔，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶底時(shí)，用消毒槍頭(10 ml)垂直孔板底面、沿中軸劃3條平行線，PBS沖洗加入不含胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，24 h后顯微鏡下拍照觀察24 h劃痕愈合照片，Visio軟件分析細(xì)胞遷移距離。

1.2.7Western blot檢測(cè)MCF-7細(xì)胞中GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin、cyclin-D1、C-Myc、MMP-7蛋白水平 取各組轉(zhuǎn)染48 h的MCF-7細(xì)胞，每組設(shè)置7個(gè)復(fù)孔，加入裂解液裂解30 min，提取總蛋白，取50 μl蛋白樣品上樣，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗(兔抗人GSK-3β單克隆抗體、兔抗人p-GSK-3β單克隆抗體、兔抗人β-catenin單克隆抗體、兔抗人cyclin-D1單克隆抗體、兔抗人C-Myc單克隆抗體、兔抗人MMP-7單克隆抗體)孵育過夜，加入二抗封閉1 h，以β-actin為內(nèi)參，ECL化學(xué)發(fā)光顯影，BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照，Image J軟件分析條帶灰度值，蛋白表達(dá)量以蛋白灰度值/β-actin灰度值表示。

2 結(jié)果

2.1乳腺癌MCF-7細(xì)胞與正常乳腺Hs578Bst細(xì)胞miR-194水平比較 乳腺癌MCF-7細(xì)胞miR-194水平顯著低于正常乳腺Hs578Bst細(xì)胞(0.24±0.05 vs 1.00±0.07,P<0.01)。

2.2各組MCF-7細(xì)胞miR-194水平比較 與Blank組和NC組相比，miR-194組miR-194水平升高(P<0.05)，Blank組和NC組miR-194水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組MCF-7細(xì)胞中miR-194水平比較

2.3各組MCF-7細(xì)胞增殖能力比較 24 h時(shí)，各組MCF-7細(xì)胞OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；48 h和72 h時(shí)，與Blank組和NC組相比，miR-194組MCF-7細(xì)胞OD值降低(P<0.05)，Blank組和NC組MCF-7細(xì)胞OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組MCF-7細(xì)胞OD值比較

2.4各組MCF-7細(xì)胞侵襲能力 與Blank組和NC組相比，miR-194組MCF-7細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)降低(P<0.05)，Blank組和NC組MCF-7細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3、圖1。

圖1 Transwell測(cè)定MCF-7細(xì)胞侵襲能力(×400)Fig.1 Transwell to determine invasive ability of MCF-7 cells (×400)

表3 各組MCF-7細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)比較

2.5各組MCF-7細(xì)胞遷移能力比較 與Blank組和NC組相比，miR-194組MCF-7細(xì)胞遷移距離降低(P<0.05)，Blank組和NC組MCF-7細(xì)胞遷移距離差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4、圖2。

圖2 劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定MCF-7細(xì)胞遷移能力(×100)Fig.2 Scratch test to determine migration ability of MCF-7 cells (×100)

表4 各組MCF-7細(xì)胞遷移距離比較

2.6各組MCF-7細(xì)胞GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin蛋白水平相比 各組MCF-7細(xì)胞GSK-3β蛋白水平相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與Blank組和NC組相比，miR-194組MCF-7細(xì)胞p-GSK-3β、β-catenin蛋白水平降低(P<0.05)，Blank組和NC組MCF-7細(xì)胞p-GSK-3β、β-catenin蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5、圖3。

表5 各組MCF-7細(xì)胞GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin蛋白水平比較

圖3 Western blot檢測(cè)各組MCF-7細(xì)胞GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin蛋白水平Fig.3 Western blot detected GSK-3β,p-GSK-3β and β-catenin proteins levels of MCF-7 cells in each group

2.7各組MCF-7細(xì)胞cyclin-D1、C-Myc、MMP-7蛋白水平 與Blank組和NC組相比，miR-194組MCF-7細(xì)胞cyclin-D1、C-Myc、MMP-7蛋白水平降低(P<0.05)，Blank組和NC組MCF-7細(xì)胞cyclin-D1、C-Myc、MMP-7蛋白水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表6、圖4。

圖4 Western blot檢測(cè)各組MCF-7細(xì)胞cyclin-D1、C-Myc、MMP-7蛋白水平電泳圖Fig.4 Western blot detected cyclin-D1,C-Myc and MMP-7 proteins levels of MCF-7 cells in each group

表6 各組MCF-7細(xì)胞cyclin-D1、C-Myc、MMP-7蛋白水平比較

3 討論

miRNA為信號(hào)分子，具有廣泛的調(diào)節(jié)功能，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[5]。miRNA可作為癌基因或抑癌基因，作為促癌基因在惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，可通過阻止惡性腫瘤細(xì)胞分化、抑制惡性腫瘤細(xì)胞凋亡、解除抑癌基因的調(diào)控等途徑促進(jìn)惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展；作為抑癌基因在惡性腫瘤中表達(dá)下調(diào)或缺失，促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞增殖作用下降，抑制惡性腫瘤細(xì)胞無限增殖[6-8]。miR-194在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常，參與多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展，如miR-194對(duì)裸鼠體內(nèi)骨肉瘤的增殖及肺部轉(zhuǎn)移具有明顯抑制作用,在裸鼠骨肉瘤中發(fā)揮抑癌基因作用，可通過靶向KDM5B抑制胃癌細(xì)胞增殖，在胃癌中發(fā)揮抑癌基因作用，通過調(diào)節(jié)BMP1和p27(kip1)表達(dá)抑制非小細(xì)胞肺癌轉(zhuǎn)移，因此miR-194在骨肉瘤、胃癌、非小細(xì)胞肺癌的惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌基因作用[9-12]。本研究對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞miR-194水平進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)MCF-7細(xì)胞miR194水平降低，過表達(dá)miR-194可抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。本研究表明miR-194在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中發(fā)揮抑癌基因作用。在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中，Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與惡性腫瘤增殖、侵襲和遷移，該通路中任何信號(hào)分子異常均可引起β-catenin聚集于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，促使下游靶基因轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，引起細(xì)胞異常增殖[13]。β-catenin是Wnt/β-catenin通路的關(guān)鍵分子，在乳腺癌中異常表達(dá)，與轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后有關(guān)；GSK-3β在真核細(xì)胞中普遍存在，為保守的絲氨酸、蘇氨酸激酶，GSK-3β磷酸化為p-GSK-3β可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及凋亡，可避免β-catenin磷酸化，在細(xì)胞質(zhì)中堆積，導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化，促進(jìn)β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核，激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控細(xì)胞分化、周期、生長(zhǎng)及遷移[14-16]。cyclin-D1、C-Myc和MMP-7為Wnt/β-catenin下游靶基因，在乳腺癌中過表達(dá)，cyclin-D1過表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移，C-Myc過表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，MMP-7過表達(dá)可促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，增強(qiáng)細(xì)胞侵襲能力[17-19]。

miR-194可通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展，Peng等[20]研究發(fā)現(xiàn)miR-194通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與胃癌發(fā)生發(fā)展，張楊等[21]研究發(fā)現(xiàn)miR-194通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與肝癌細(xì)胞增殖和侵襲。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，miR-194可通過Wnt/β-catenin信號(hào)參與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展，因此推測(cè)miR-194可能通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲遷移。本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-194可下調(diào)p-GSK-3β、β-catenin、cyclin-D1、C-Myc、MMP-7蛋白水平，表明miR-194可通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活、下調(diào)其下游基因發(fā)揮抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。

綜上所述，miR-194可通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制乳腺癌發(fā)生發(fā)展，但本研究?jī)H對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞進(jìn)行研究，miR-194在其他乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況及其在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的表達(dá)情況有待進(jìn)一步研究。