陳朝祥 周淑平 王鄭鋼 張 衛(wèi) 向 亮 侯 威 伍俊星

(南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院關(guān)節(jié)運(yùn)動科，衡陽 421002)

骨折愈合是一個極其復(fù)雜的組織學(xué)和生物化學(xué)變化過程。研究顯示，臨床約有5%～10% 患者出現(xiàn)骨折愈合延遲，需進(jìn)一步手術(shù)治療，給患者及其家庭帶來負(fù)擔(dān)[1,2]。谷紅注射液為中西藥復(fù)方制劑，其主要成分為紅花提取物及乙酰谷酰胺。其中乙酰谷酰胺是谷氨酰胺乙酰化的衍生物，屬于一種神經(jīng)肽，作為臨床上廣泛應(yīng)用的腦功能改善輔助劑，已得到一系列臨床試驗(yàn)的證實(shí)[3,4]；而紅花主要功效為祛瘀止痛、活血通經(jīng)，對跌打損傷以及關(guān)節(jié)疼痛等癥狀治療效果顯著，目前關(guān)于谷紅注射液對大鼠骨折愈合作用研究較少。本研究通過制備骨折大鼠模型，觀察谷紅注射液對其骨礦物質(zhì)密度(BMD)、血清堿性磷酸酶(ALP)、成纖維細(xì)胞生長因子2(FGF-2)等的影響，為初步確定和評判谷紅注射液促進(jìn)骨折愈合的作用提供藥理實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 選取清潔級SD 大鼠72只，雄性，8～10周齡，體質(zhì)量(200±20)g，許可證號：SCXK(湘) 2013-0005，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供。本研究通過南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院倫理委員會審查。

1.1.2試藥與儀器 谷紅注射液(通化谷紅制藥有限公司)；復(fù)方骨肽注射液(南京新百藥業(yè)有限公司，批號 170522)；FGF-2免疫組化試劑盒 (美國 HyClone-PIERCE公司)；ALP檢測試劑盒(德國 Roche Diagnostics GmbH)；FGF-2試劑盒(ELISA，上海撫生實(shí)業(yè)有限公司)；X線骨密度儀和ELISA 酶標(biāo)儀(德國Roche 公司)。

1.2方法

1.2.1大鼠骨折模型制作 大鼠采用10%水合氯醛麻醉，右側(cè)小腿脛骨常規(guī)消毒后切開約2 cm，向外分離皮膚，然后在脛骨結(jié)節(jié)下1 cm截?cái)嗝劰?，制造橫行骨折，髓內(nèi)采用0.8 mm醫(yī)用配藥針頭固定骨折斷段，關(guān)閉切口。

1.2.2分組與給藥 造模成功后，將SD大鼠隨機(jī)分為對照組(生理鹽水灌胃)、谷紅注射液組[谷紅注射液，10 ml/(kg·d)腹腔注射]，陽性藥組[復(fù)方骨肽注射液，5 ml/(kg·d)腹腔注射]，每組24只。

1.2.3影像學(xué)檢查 分別于建模后第2、4、6周各組隨機(jī)選取8只大鼠，脫頸法處死大鼠，采用X線機(jī)觀察骨折情況。影像學(xué)條件：柯達(dá)底片，大鼠后肢距膠片距離25 cm，曝光時間1.25 s，放大倍率約33%，進(jìn)行X線掃描拍片。骨折愈合評分采用Garrett等骨折愈合影像學(xué)標(biāo)準(zhǔn)[5]。

1.2.4BMD檢測 影像學(xué)檢查后切開大鼠骨折處皮膚暴露脛骨，斷離右下肢保留脛骨全長，拔除髓內(nèi)針，將脛骨周圍軟組織剝離，注意保護(hù)骨折端愈合的骨痂組織，防止骨折端分離，進(jìn)行離體BMD測量。

1.2.5HE染色 大鼠在不同時段分批進(jìn)行BMD 檢測后，將右側(cè)脛骨于4%多聚甲醛中固定，PBS沖洗后轉(zhuǎn)入乙醇固定，進(jìn)行骨組織脫鈣，大鼠脛骨置于脫鈣液中脫鈣3周。脫鈣完成后用蒸餾水沖洗兩遍，酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片，干燥后進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6ALP及FGF-2檢測 造模后第2、4、6周時，各組隨機(jī)選取8只大鼠進(jìn)行尾靜脈取血，離心5 min，室溫放置，8 h內(nèi)完成血清ALP濃度檢測。檢測采用日立7600全自動生化儀檢測，所有實(shí)驗(yàn)均按說明書進(jìn)行操作；同時，采用ELISA法對血清中FGF-2進(jìn)行檢測，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作，記錄酶標(biāo)儀OD值。

1.2.7免疫組化檢測 造模后第2、4、6周時，各組隨機(jī)選取8只大鼠，脫頸法處死大鼠，取右側(cè)脛骨，進(jìn)行骨組織脫鈣，大鼠脛骨置于脫鈣液中脫鈣3周。脫鈣完成后用蒸餾水沖洗，酒精梯度脫水，透明12 h，骨組織包埋切片，干燥后進(jìn)行免疫組化染色，顯微鏡下觀察，使用 Image J 圖像分析軟件對所有視野進(jìn)行平均光密度(MOD)值測定。

2 結(jié)果

2.1影像學(xué)檢查結(jié)果 2周時，GHI組和陽性藥組較對照組出現(xiàn)部分軟骨痂，均無明顯骨連接。4周時，GHI組和陽性藥組較對照組出現(xiàn)的骨連接增多，見圖1；根據(jù)Garrett評分標(biāo)準(zhǔn)，與對照組相比，第2、4周時GHI組和陽性藥組評分均升高，而術(shù)后6周，基本進(jìn)入塑形期，見表1。

圖1 各組大鼠骨折后X線情況Fig.1 Condition of X-ray after fracture in rats of each group

表1 各組大鼠骨組織評分

2.2骨密度測定 在術(shù)后3個時段測定BMD值結(jié)果顯示，GHI組和陽性藥組BMD值均高于對照組(P<0.05)，但GHI組與陽性藥組組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2。

圖2 各組大鼠骨密度值Fig.2 Done mineral density of rats in each groupNote:n=8.Compared with control group,*.P<0.05.

2.3骨組織HE染色結(jié)果 第2周時，GHI組和陽性藥組HE切片軟骨細(xì)胞數(shù)量多于對照組，同時部分出現(xiàn)不成熟骨小梁，而對照組無骨小梁。4周時，對照組骨折端仍以軟骨組織為主，少數(shù)切片存在纖維組織。GHI組和陽性藥組的軟骨組織及纖維組織逐漸被不成熟骨組織替代，甚至部分出現(xiàn)較成熟骨小梁結(jié)構(gòu)。6周時對照組和GHI組以軟骨組織與不成熟骨組織交替為主，而陽性藥組出現(xiàn)部分成熟骨組織，3組間無明顯差異，見圖3。

圖3 HE染色觀察骨組織變化Fig.3 Changes of bone tissues observed by HE

2.4血清ALP及FGF-2檢測結(jié)果 在術(shù)后2周，表現(xiàn)出陽性藥組ALP含量高于GHI組及對照組。但在第4、6周，對照組、陽性藥組和GHI組間ALP 含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。而GHI組和陽性藥組血清中FGF-2含量在第2、4、6周時均明顯高于對照組(P<0.01)，見圖4。

圖4 各組大鼠血清ALP及FGF-2變化Fig.4 Changes of serum ALP and FGF-2 in each groupNote:Compared with control group,*.P<0.05,#.P<0.01.

2.5骨組織FGF-2表達(dá)結(jié)果 在造模成功后第2周GHI組和陽性藥組MOD值均較對照組高，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；第4周時各組FGF-2的MOD值較第2周均下降，但GHI組和陽性藥組MOD值均比對照組高(P<0.01)，GHI組和陽性藥組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；術(shù)后第6周，3組間MOD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖5。

圖5 各組大鼠不同時段FGF-2表達(dá)變化Fig.5 Changes of FGF-2 expression in different periods of rats in each groupNote:n=8.Compared with control group,*.P<0.05；#.P<0.01.

3 討論

骨折愈合被認(rèn)為是骨重建過程，在骨的形成和再吸收過程中破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞發(fā)揮重要作用，而骨細(xì)胞通過調(diào)節(jié)骨的形成和再吸收，影響破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞[6，7]。目前對GHI在骨折愈合方面的研究較少，同時缺乏驗(yàn)證其療效的國際公認(rèn)的影像學(xué)及組織學(xué)評判標(biāo)準(zhǔn)。因此本研究目的是觀察不同時段GHI對FGF-2表達(dá)的影響以及促骨折愈合的效果。

骨肽注射液含有多種骨代謝的活性肽類，具有促進(jìn)骨細(xì)胞增殖和破骨細(xì)胞凋亡的作用[8，9]，因此本實(shí)驗(yàn)將骨肽注射液作為陽性對照藥物；谷紅注射液是由乙酰谷酰胺和紅花提取液制成的滅菌水溶液，紅花提取液含有紅花黃色素及紅花苷類等有效成分，具有抗氧自由基、抑制血小板凝聚、改善微循環(huán)及降血脂等作用，但有關(guān)骨折方面研究甚少[10,11]。

影像學(xué)結(jié)果顯示，2周時，GHI組和陽性藥組較對照組出現(xiàn)部分軟骨痂，均無明顯骨連接。4周時，GHI組和陽性藥組較對照組出現(xiàn)的骨連接更多。根據(jù)Garrett評分標(biāo)準(zhǔn)，與對照組相比，第2、4周時GHI組和陽性藥組評分均升高，術(shù)后6周，基本進(jìn)入塑形期。說明GHI組和陽性藥組具有促進(jìn)早期骨折愈合效果；BMD檢查結(jié)果顯示，在不同的時段GHI組和陽性藥組BMD值均高于對照組，說明GHI組具有增加骨礦含量的作用；骨組織HE染色結(jié)果顯示，第4周時，對照組骨折端仍以軟骨組織為主，GHI組和陽性藥組的軟骨組織及纖維組織逐漸被不成熟骨組織替代，這說明谷紅注射液能有效促進(jìn)骨愈合；ALP檢測結(jié)果顯示，在術(shù)后2周，GHI組ALP含量高于對照組(P<0.05)，這說明GHI刺激 ALP 活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，與增強(qiáng)骨鈣素轉(zhuǎn)錄和膠原的分泌等密切相關(guān)[12]。在第4、6周，3組大鼠ALP含量變化不明顯。這可能原因是：ALP被認(rèn)為是骨礦化早期標(biāo)記物，因此GHI對早期ALP刺激作用明顯，而對后期ALP刺激作用減弱，導(dǎo)致ALP表達(dá)下降。ALP、BMP增加可能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和骨基質(zhì)分泌，進(jìn)而促進(jìn)骨折愈合。

FGF-2廣泛存在于人體內(nèi)，參與器官創(chuàng)傷修復(fù)，屬于創(chuàng)傷愈合因子之一。FGF-2能通過趨化作用使巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等細(xì)胞向創(chuàng)傷部位聚集，從而促進(jìn)創(chuàng)傷的愈合，同樣在骨折愈合中也起到重要作用[13，14]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在血清和骨組織中，GHI能促進(jìn)FGF-2表達(dá)，在骨折造模后第 2 周FGF-2血清含量和蛋白表達(dá)到達(dá)高峰，GHI組和陽性藥組MOD值均較對照組高(P<0.01)，而在第4、6周FGF-2表達(dá)均逐漸下降，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本一致[15]。而且GHI組大鼠骨折部位FGF-2表達(dá)較對照組明顯增加，提示GHI促進(jìn)骨折端FGF-2表達(dá)與大鼠骨折愈合相關(guān)，且GHI可能通過FGF-2的作用，在骨折愈合早期促進(jìn)血管的形成，促進(jìn)骨折愈合。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過建立骨折大鼠模型，在不同時段從影像學(xué)、組織學(xué)等方面進(jìn)行評估，證實(shí)GHI能促進(jìn)大鼠骨折愈合，其機(jī)制可能與促進(jìn) FGF-2 表達(dá)有關(guān)，但具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。