代繼源 劉文杰 王春輝

(山東省昌邑市人民醫(yī)院胃腸肛腸外科，昌邑 261300)

結(jié)腸癌是全球范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，位居胃腸道腫瘤發(fā)病率前三，且不斷上升[1，2]。結(jié)腸癌治療以降低復(fù)發(fā)率和提高存活率為主要目標(biāo)，包括手術(shù)治療、化學(xué)治療和放射治療等綜合治療手段。目前，多種植物提取物被用于結(jié)腸癌防治，在亞洲，大黃廣泛用于發(fā)熱、腹瀉治療，具有解毒功效，主要活性成分是蒽醌類化合物，其中大黃酚對(duì)許多腫瘤細(xì)胞活性均有抑制作用，可通過線粒體鈣超載誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞死亡、并抑制其侵襲性；通過調(diào)節(jié)ROS、AKT和ERK1/2信號(hào)通路誘導(dǎo)絨毛膜癌細(xì)胞凋亡，抑制大腸癌細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等[3-6]。然而，大黃酚對(duì)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的作用尚未闡明。本實(shí)驗(yàn)以人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株為研究對(duì)象，研究大黃酚對(duì)其體外增殖、侵襲和體內(nèi)腫瘤形成的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1材料 人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心；SPF級(jí)裸鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在我院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)下進(jìn)行。RPMI1640培養(yǎng)液、FBS、0.25%胰蛋白酶、DMSO購自美國Gibco公司；注射用硫酸鏈霉素購自華北制藥股份有限公司；注射用青霉素鈉購自上海新先鋒藥業(yè)有限公司；RIPA裂解液、大黃酚(純度≥98%)購自美國Sigma公司，大黃酚用DMSO和無血清培養(yǎng)基溶解配制；BCA試劑盒購自碧云天生物科技公司；單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購自美國Santa Cruze公司；免疫組化檢測(cè)試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Transwell小室購自北京優(yōu)尼康生物技術(shù)有限公司；Matrix基質(zhì)膠購自美國BD公司。

1.1.2儀器 恒溫培養(yǎng)箱購自美國ThermoForma公司；PCR儀、電泳儀和半干轉(zhuǎn)膜儀購自美國BIO-RAD公司；Gel View 6000化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購自廣州云星儀器有限公司；低溫離心機(jī)購自美國IEC公司；超凈工作臺(tái)購自蘇州中亞凈化設(shè)備有限公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480細(xì)胞懸浮于含10%FBS和1%青鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合率達(dá)到80%以上時(shí)消化傳代。用配好的培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液。

1.2.25-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)染色檢測(cè)細(xì)胞增殖情況 接種第3代SW480細(xì)胞于96孔板，每孔加入2×104個(gè)/ml細(xì)胞懸液200 μl，待細(xì)胞貼壁后，用含0.4%FBS的培養(yǎng)液同步化孵育細(xì)胞72 h。將細(xì)胞分為4組，分別加入不同濃度大黃酚(終濃度分別為0、25、50、100 μmol/L)處理48 h，加入終濃度為0.03 μg/ml的Brdu，繼續(xù)孵育40 min。棄培養(yǎng)液，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min。鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野觀察并拍照。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，每組6個(gè)復(fù)孔。Brdu陽性細(xì)胞呈綠色熒光，Brdu陽性細(xì)胞標(biāo)記率=綠色熒光細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.3劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 以1×105個(gè)/ml密度接種SW480細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁后，用10 μl槍頭垂直劃痕，PBS洗去脫落細(xì)胞。將細(xì)胞隨機(jī)分為4組，加入10 μg/ml絲裂霉素C并分別給予不同濃度大黃酚(終濃度分別為0、25、50、100 μmol/L)處理后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。于光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察并拍照，劃痕閉合率 =(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.4Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 提前用Matrigel基質(zhì)膠包被Transwell小室上層，以1×105個(gè)/ml密度接種SW480細(xì)胞，培養(yǎng)液不加FBS，Transwell小室下層加入含F(xiàn)BS的細(xì)胞培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后，用無菌棉簽拭去Matrigel基質(zhì)膠和小室上層細(xì)胞，PBS洗滌2次后，4%多聚甲醛固定小室，結(jié)晶紫染色遷移至小室下層的SW480細(xì)胞，流水沖洗后自然晾干。鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野計(jì)數(shù)染色細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每組6個(gè)復(fù)孔。

1.2.5免疫熒光法檢測(cè)大黃酚對(duì)波形蛋白(vimentin)表達(dá)的影響 細(xì)胞分組方法1.2.3，各組用PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，輕輕去除固定液，PBS漂洗3次，加入1 ml DAPI染液，室溫染色5 min，輕輕吸去染液，PBS漂洗3次，鏡下觀察。

1.2.6免疫組織化學(xué)法檢測(cè)移植瘤裸鼠腫瘤組織Ki67和VEGF表達(dá)情況 SPF級(jí)裸鼠無菌環(huán)境飼養(yǎng)，溫度為26～28℃，濕度為50%～60%，光照10 h，自由采食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。取結(jié)腸癌SW480細(xì)胞并調(diào)整密度至2×107個(gè)/ml，于裸鼠頸部相同部位皮下注射上述細(xì)胞懸液0.2 ml以建立移植瘤裸鼠模型。次日，將模型動(dòng)物隨機(jī)分為4組，每組10只，分別1次/d腹腔注射PBS和12.5、25、50 mg/kg 大黃酚，每天給藥1次，連續(xù)給藥30 d。實(shí)驗(yàn)完成時(shí)摘取腫瘤并稱重，制成約4 μm的石蠟切片，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分色，光學(xué)顯微鏡下觀察Ki67和VEGF表達(dá)情況。

1.2.7Western blot檢測(cè)增殖、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 用含蛋白抑制劑的RIPA蛋白裂解液于冰上裂解，提取各組細(xì)胞或腫瘤組織總蛋白，12 000 g 4℃離心10 min，取上清用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。蛋白變性后，取等量蛋白凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉蛋白質(zhì)2 h，加入一抗，4℃孵育過夜。棄一抗，緩沖液清洗后加入對(duì)應(yīng)二抗，室溫孵育1 h。滴加電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色液于暗室曝光顯影，以GAPDH為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1大黃酚對(duì)體外培養(yǎng)SW480細(xì)胞增殖能力的影響 Brdu染色結(jié)果顯示，隨著大黃酚濃度增加，綠色熒光逐漸減少，Brdu陽性細(xì)胞數(shù)量呈劑量依賴性減少(P<0.05或P<0.01)，見圖1、2。免疫組織化學(xué)法和Western blot檢測(cè)SW480細(xì)胞的增殖相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)的結(jié)腸癌SW480細(xì)胞高表達(dá)Ki67和PCNA蛋白；經(jīng)不同濃度的大黃酚處理后，兩者表達(dá)水平均呈劑量依賴性降低(P<0.05或P<0.01)，見圖2、3。結(jié)果提示，大黃酚可呈劑量依賴性減弱SW480細(xì)胞的增殖能力。

圖1 Brdu染色檢測(cè)SW480細(xì)胞增殖能力Fig.1 Proliferation ability of SW480 cells were detected by Brdu staining

圖2 大黃酚對(duì)SW480細(xì)胞增殖及增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of chrysophanol on proliferation and expression of proliferation-related protein in SW480 cellsNote:Compared with control group,**.P<0.01;compared with chrysophanol (25 μmol/L) group,#.P<0.05;compared with chrysophanol (50 μmol/L) group,△.P<0.05.

圖3 Western blot檢測(cè)SW480細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.3 Expresions of proliferation-related proteins in SW480 cells were detected by Western blot

2.2大黃酚對(duì)體外培養(yǎng)SW480細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與未經(jīng)大黃酚處理組相比，各給藥組細(xì)胞劃痕閉合率均呈劑量依賴性減少(P<0.05或P<0.01)，見圖4、5。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與未經(jīng)大黃酚處理組相比，各給藥組侵襲細(xì)胞數(shù)量明顯減少，且大黃酚濃度越大，侵襲細(xì)胞數(shù)越少(P<0.05或P<0.01)，見圖5、6。結(jié)果提示，大黃酚能呈劑量依賴性地降低SW480細(xì)胞遷移及侵襲能力。

圖4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SW480細(xì)胞遷移情況Fig.4 Migration of SW480 cells was detected by scratch assay

圖5 大黃酚對(duì)SW480細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響Fig.5 Effects of chrysophanol on migration and invasion of SW480 cellsNote:Compared with control group,**.P<0.01;compared with chrysophanol (25 μmol/L) group,#.P<0.05；compared with chrysophanol (50 μmol/L) group,△.P<0.05.

圖6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SW480細(xì)胞侵襲能力Fig.6 Invasive ability of SW480 cells were detected by Transwell

2.3大黃酚對(duì)體外培養(yǎng)SW480細(xì)胞腫瘤上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與未經(jīng)大黃酚處理組相比，各給藥組遷移相關(guān)蛋白VEGF、間充質(zhì)標(biāo)記蛋白N-cadherin的表達(dá)水平顯著降低，且與大黃酚給藥濃度呈負(fù)相關(guān)；而上皮標(biāo)記蛋白E-cadherin的表達(dá)水平呈大黃酚劑量依賴性上調(diào)(P<0.05或P<0.01)，見圖7、8。免疫熒光法結(jié)果顯示，與未經(jīng)大黃酚處理組相比，各給藥組SW480細(xì)胞內(nèi)波形蛋白熒光量隨大黃酚濃度增加而顯著降低，即波形蛋白表達(dá)量呈大黃酚劑量依賴性降低(P<0.05或P<0.01)，見圖8、9。因此，大黃酚能呈劑量依賴性地抑制體外培養(yǎng)SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力。

圖7 Western blto蛋白印跡法檢測(cè)SW480細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.7 Expresions of EMT-related proteins in SW480 cells were detected by Western blot

圖8 大黃酚對(duì)SW480細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響Fig.8 Effects of chrysophanol on EMT of SW480 cellsNote:Compared with control group,**.P<0.01;compared with chrysophanol (25 μmol/L) group,#.P<0.05；compared with chrysophanol (50 μmol/L) group,△.P<0.05.

圖9 免疫熒光法檢測(cè)Vimentin蛋白表達(dá)Fig.9 Expresion of Vimentin protein was detected by immunofluorescence

2.4大黃酚對(duì)體外培養(yǎng)SW480細(xì)胞信號(hào)通路的影響 Western blot結(jié)果顯示，與未經(jīng)大黃酚處理組相比，大黃酚給藥組AMPKα1磷酸化水平均明顯增強(qiáng)，且各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與大黃酚濃度呈正相關(guān)(P<0.05或P<0.01)，見圖10；各給藥組P-mTOR/mTOR和cyclin D1的表達(dá)水平明顯下降，與大黃酚濃度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05或P<0.01)，見圖10。提示大黃酚可促進(jìn)SW480細(xì)胞AMPKα1磷酸化激活，而對(duì)mTOR和cyclin D1的表達(dá)則表現(xiàn)出明顯抑制作用，且均呈劑量依賴性。

圖10 大黃酚對(duì)SW480細(xì)胞信號(hào)通路的影響Fig.10 Effect of chrysophanol on signaling pathway of SW480 cellsNote:Compared with control group,**.P<0.01;compared with chrysophanol (25 μmol/L) group,#.P<0.05;compared with chrysophanol (50 μmol/L) group,△.P<0.05.

2.5大黃酚對(duì)結(jié)腸癌移植瘤小鼠腫瘤形成的影響 移植瘤小鼠存活率顯示，與對(duì)照組相比，各給藥組移植瘤小鼠存活率遞減，見圖11。各組移植瘤小鼠腫瘤重量顯示，與對(duì)照組(0.45±0.09)g相比，各給藥組移植瘤小鼠的腫瘤重量分別為(0.32±0.06)g、(0.24±0.07)g和(0.15±0.04)g，即隨大黃酚劑量增加，腫瘤重量減小(P<0.05或P<0.01)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，隨大黃酚給藥濃度增加，各給藥組小鼠腫瘤組織中p-AMPK/AMPK表達(dá)水平顯著上調(diào)，P-mTOR/mTOR和cyclin D1表達(dá)水平顯著下調(diào)，且均與大黃酚劑量相關(guān)(P<0.05或P<0.01)，見圖12、13。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，大黃酚給藥濃度越大，腫瘤組織Ki67和VEGF陽性顆粒越少(P<0.05或P<0.01)，見圖13、14，即大黃酚可抑制Ki67、VEGF表達(dá)。結(jié)果提示，大黃酚能劑量依賴性地促進(jìn)AMPKα1激活、抑制mTOR和cyclin D1蛋白表達(dá)，從而抑制腫瘤在移植瘤小鼠體內(nèi)的形成，降低移植瘤小鼠腫瘤組織重量，提高小鼠存活率。

圖11 移植瘤小鼠存活率Fig.11 Survival rate of transplanted tumors in mice

圖12 Western blot檢測(cè)腫瘤組織中通路蛋白表達(dá)Fig.12 Expresions of pathway proteins in tumor tissue were detected by Western blot

圖13 大黃酚對(duì)結(jié)腸癌移植瘤模型小鼠腫瘤形成的影響Fig.13 Effect of chrysophanol on tumorigenesis of colon cancer model miceNote:Compared with control group,**.P<0.01;compared with chrysophanol group (25 mg/kg),#.P<0.05；compared with chrysophanol (50 mg/kg) group,△.P<0.05.

圖14 免疫組化檢測(cè)腫瘤組織中Ki67和VEGF表達(dá)情況Fig.14 Expresion of Ki67 and VEGF in tumor tissue were detected by immunohistochemical

3 討論

結(jié)腸癌是三大惡性腫瘤之一，具有較高的發(fā)病率和病死率，其發(fā)生與多種因素相關(guān)，包括細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡、腫瘤微環(huán)境和自身免疫系統(tǒng)。中醫(yī)藥已廣泛用于癌癥治療，作用于多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑且不良反應(yīng)較少[7]。大黃酚是中藥大黃的有效成分之一，是蒽醌類化合物，具有多種生物學(xué)活性，如對(duì)絨毛膜癌、前列腺癌的抗腫瘤活性[4,8,9]。目前，關(guān)于大黃酚對(duì)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖的作用尚未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)選取人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞，探討大黃酚對(duì)SW480細(xì)胞的影響及機(jī)制。

抑制腫瘤細(xì)胞增殖是抗癌藥發(fā)揮作用的重要途徑。研究表明，同為大黃提取物的大黃酸，對(duì)表皮生長因子受體(EGFR)過表達(dá)的SNU-C5人結(jié)腸癌細(xì)胞具有抗癌活性，通過抑制EGFR/mTOR信號(hào)通路阻斷結(jié)腸癌細(xì)胞增殖發(fā)揮作用[10]。而大黃酚能抑制體外培養(yǎng)的乳腺癌MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗乳腺癌作用[8]。本研究發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)的人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中，大黃酚可劑量依賴性地抑制增殖相關(guān)蛋白Ki67和KCNA表達(dá)，降低Brdu陽性細(xì)胞數(shù)，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

另外，抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移是抗癌藥的又一重要途徑。研究表明，抑制腫瘤細(xì)胞中VEGF表達(dá)可有效抑制其增殖和轉(zhuǎn)移，且VEGF家族及其受體可能是惡性腫瘤新的預(yù)后標(biāo)志物[11-13]。決明子蒽酮-C-糖苷、決明子苷在結(jié)腸癌荷瘤小鼠體內(nèi)的抗腫瘤和抗轉(zhuǎn)移作用主要與抑制VEGF和MMP-9表達(dá)及VEGFR-2磷酸化等有關(guān)[14]。EMT是上皮細(xì)胞失去極性、獲得間充質(zhì)特性而增加轉(zhuǎn)移和侵襲的過程，是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移和侵襲的重要過程[15,16]。當(dāng)發(fā)生EMT時(shí)，上皮標(biāo)記蛋白E-cadherin明顯下調(diào)，同時(shí)間充質(zhì)標(biāo)記波形蛋白表達(dá)上升[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，大黃酚能抑制細(xì)胞侵襲，下調(diào)VEGF、N-cadherin及波形蛋白，上調(diào)E-cadherin蛋白表達(dá)，從而抑制體外培養(yǎng)SW480細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase)最是新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)能量代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，通過感受細(xì)胞質(zhì)內(nèi)AMP/ATP比例變化調(diào)節(jié)新陳代謝，在應(yīng)激過程中可抑制細(xì)胞增殖或提高細(xì)胞存活率，在癌癥治療和預(yù)防中的作用受到廣泛關(guān)注[18,19]。體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，AMPK的激活將抑制熱休克因子-1(HSF1)活性，從而抑制胰腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[20]；肝激酶B1(LKB1)磷酸化激活A(yù)MPK，可負(fù)調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖和代謝，且LKB1/AMPK信號(hào)通路參與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，是腫瘤向更高病理級(jí)別惡性進(jìn)展的重要標(biāo)志[21]。非甾體類抗炎藥阿司匹林可通過AMPK-mTOR-Akt/ERK軸抑制肝癌HepG2細(xì)胞和結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡[18]。槲皮素(quercetin)則能通過調(diào)節(jié)Sestrin2-AMPK-mTOR信號(hào)通路提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平，從而誘導(dǎo)HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡[22]。另外，細(xì)胞周期素D1 (cyclin D1)在許多惡性腫瘤細(xì)胞生長中發(fā)揮關(guān)鍵作用[23]。cyclin D1的轉(zhuǎn)錄激活可以抑制順鉑對(duì)小鼠胰腺癌細(xì)胞的殺傷作用，即cyclin D1表達(dá)下調(diào)可抑制腫瘤生長[24]?？Х榷勾纪ㄟ^ERK1/2、JNK和GKS3β依賴性蘇氨酸-286磷酸化誘導(dǎo)cyclin D1 蛋白酶體降解，從而抑制大腸癌HCT116、SW480細(xì)胞增殖[25]。大黃酚通過NF-κB/cyclin D1和NF-κB/Bcl-2信號(hào)通路級(jí)聯(lián)抑制乳腺癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。本研究結(jié)果表明，大黃酚可濃度依賴性地抑制人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的體外增殖、侵襲和體內(nèi)腫瘤形成，促進(jìn)移植瘤小鼠存活，其作用機(jī)制與介導(dǎo)AMPK依賴性信號(hào)通路有關(guān)。

本研究認(rèn)為，大黃酚能劑量依賴性地下調(diào)增殖相關(guān)蛋白Ki67和PCNA表達(dá)，通過影響AMPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)影響SW480細(xì)胞增殖；還能通過影響E-cadherin、VEGF、N-cadherin和Vimentin表達(dá)水平調(diào)控SW480細(xì)胞EMT能力。另外，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，大黃酚能促進(jìn)荷瘤劑量組小鼠存活，降低腫瘤組織重量，影響Ki67、PCNA及AMPK信號(hào)通路蛋白表達(dá)，從而有效抑制腫瘤的體內(nèi)形成。綜上所述，大黃酚能介導(dǎo)AMPK依賴性信號(hào)通路抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的增殖、侵襲和體內(nèi)腫瘤形成，其可作為結(jié)腸癌的治療新型藥物。