賀子秋 杜 丹 張 志 付海波 胡忠貴 舒 峰

(三峽大學(xué)第二人民醫(yī)院泌尿外科，宜昌 443000)

近年來，前列腺癌(prostate cancer，PCa)的發(fā)病率逐年增高，已成為男性生殖系統(tǒng)最常見惡性腫瘤。調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，老齡化人口特別是60歲以上的男性發(fā)病率明顯升高[1,2]。PCa的發(fā)病原因復(fù)雜，除遺傳因素外，還與性活動、飲食習(xí)慣等有關(guān)。病例對照研究表明，性伴侶較少、初次性交年齡較大、適度射精的男性患PCa的風(fēng)險(xiǎn)更低[3]。美國癌癥協(xié)會2018年公布的癌癥死亡率最新數(shù)據(jù)顯示，PCa的致死率僅次于肺癌位居第二，且PCa的發(fā)病率在亞洲國家呈逐年上升趨勢[4,5]。PCa發(fā)病機(jī)制尚不明確，因此，研究其發(fā)病機(jī)制、探索其有效診斷和治療手段已成為現(xiàn)階段PCa研究領(lǐng)域的重要方向。本研究主要通過公共基因芯片數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus，GEO)下載2組PCa表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)，篩選出PCa組織與正常前列腺組織差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)，對其進(jìn)行功能注釋、通路分析、蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，篩選出2個(gè)存在上下調(diào)關(guān)系的DEGs，并通過文獻(xiàn)檢索確定國內(nèi)外尚無此2種基因與PCa關(guān)系的相關(guān)研究，采用Western blot和免疫組化法檢測PCa組織中這2種蛋白的表達(dá)情況，評估其與PCa病理參數(shù)的關(guān)系，探討其在PCa發(fā)生發(fā)展過程中的作用，為PCa的病因?qū)W研究提供依據(jù)，也為其早期診斷、治療和預(yù)后提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1數(shù)據(jù)來源 基因芯片數(shù)據(jù)來源于美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的GEO數(shù)據(jù)庫，編號分別為GSE69223、GSE28204，包含19例PCa組織和19例正常組織(包括前列腺增生和癌旁組織)。

1.1.2樣本來源 收集2018年1月～2019年8月在我院就診的40例PCa及40例良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia，BPH)患者的手術(shù)標(biāo)本，分為觀察組及對照組。觀察組平均年齡為73.55歲(56～91歲)，對照組平均年齡為72.34歲(61～88歲)，所有患者術(shù)前均未行放化療及免疫治療。本研究經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者知情同意。

1.1.3主要試劑和儀器 兔抗WNT6單克隆抗體(ab154144)、兔抗FZD7多克隆抗體(ab64636)、兔抗WNT6多克隆抗體(ab150588)均購自Abcam公司；小鼠抗β-actin抗體購自Santa公司；辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗小鼠IgG、5×蛋白上樣緩沖液購自Servicebio公司；PVDF膜購自GE Life Science公司；預(yù)染蛋白Marker購自Thermo Scientific公司；DAB試劑盒、SP試劑盒購自DAKO公司；全自動脫水機(jī)、RM2145切片機(jī)、CS-VI型烤片機(jī)購自Leica公司；BX53F顯微鏡購自O(shè)LYMPUS公司；全封閉脫水機(jī)購自SHANDON公司；電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)購自北京凱元信銳公司；全波長酶標(biāo)儀購自Thermo Fisher公司；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自Biosine公司。

1.2方法

1.2.1生物信息學(xué)分析 limma法篩選出PCa和BPH的DEGs，以P<0.05和|log (FC) |≥1為標(biāo)準(zhǔn)，取2個(gè)數(shù)據(jù)集篩選出的DEGs交集以降低假陽性率，獲得的基因集作為PCa和BPH差異表達(dá)的基因進(jìn)行后續(xù)分析。DAVID軟件進(jìn)行GO(gene ontology)富集分析，KOBAS軟件對篩選出的基因進(jìn)行KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)信號通路分析；STRING在線數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件對DEGs進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)分析，MCODE插件計(jì)算關(guān)鍵基因和關(guān)鍵模塊，篩選出富集于同一信號通路的2種基因，確定其上下游關(guān)系，通過文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，下調(diào)基因WNT6及其假定受體FZD7與PCa的相關(guān)性尚未見報(bào)道[6,7]。

1.2.2Western blot檢測WNT6及FZD7蛋白含量 組織充分研磨后提取總蛋白，檢測蛋白濃度，取相同質(zhì)量蛋白加入上樣緩沖液，煮沸變性10 min，配制12%分離膠及4%濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，4 ℃ 75 V恒壓轉(zhuǎn)膜120 min，5%脫脂奶粉封閉2 h，WNT6、FZD7抗體(1∶1 000)和β-actin抗體(1∶3 000)4 ℃孵育過夜，洗膜后分別加入抗兔和抗小鼠二抗(1∶5 000)室溫孵育55 min，洗膜，DAB法顯影，Image J軟件對圖像進(jìn)行灰度值分析，以β-actin灰度值為基準(zhǔn)，結(jié)果以(WNT6/FZD7)/β-actin表示。

1.2.3免疫組化法檢測WNT6及FZD7蛋白含量 標(biāo)本離體后經(jīng)10%甲醛固定液固定24 h后石蠟包埋，切為4 μm切片置于載玻片，65℃恒溫烤片2 h，依次于脫蠟液Ⅰ、Ⅱ中浸泡5 min，無水乙醇Ⅰ、Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇中浸泡2 min，熱抗原修復(fù)后進(jìn)行抗體孵育(劃線、滴加一抗，WNT6抗體稀釋度為1∶50；FZD7抗體稀釋度為1∶150)，37℃恒溫箱中孵育60 min，PBS沖洗3次，滴加二抗溶液37℃孵育 30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染5 min，蒸餾水沖洗，溫水返藍(lán)1 min，脫水，透明，中性樹脂封片，顯微鏡下讀片。

結(jié)果判斷：WNT6蛋白主要位于細(xì)胞漿和細(xì)胞膜，F(xiàn)ZD7蛋白主要位于細(xì)胞膜，分別以細(xì)胞漿、細(xì)胞膜和細(xì)胞膜出現(xiàn)淺黃色、棕黃色和棕褐色顆粒為陽性表達(dá)。雙盲法閱片，評價(jià)細(xì)胞染色強(qiáng)度：0分：未著色，1分：淺黃色，2分：棕黃色，3分：棕褐色。評價(jià)陽性細(xì)胞百分率：<5%記0分，6%～25%記1分，26%～50%記2分，51%～75%記3分，>75%記4分。總得分為2者得分之積，≥4分為陽性表達(dá)，<4分為陰性表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析檢驗(yàn)，Western blot結(jié)果使用GraphPad Prism7進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，樣本率比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1DEGs篩選 數(shù)據(jù)集GSE69223、GSE28204中分別篩選出5 933和1 568個(gè)DEGs，取2個(gè)數(shù)據(jù)集DEGs的交集進(jìn)行綜合分析，得到相同DEGs 743個(gè)。以P<0.05和|log (FC) |≥1為標(biāo)準(zhǔn)，得到DEGs 286個(gè)，其中上調(diào)基因53個(gè)，下調(diào)基因233個(gè)。按P值和差異倍數(shù)排序并挑選出差異較大的前30個(gè)基因，PCa組織和BPH組織間基因表達(dá)差異明顯且分組聚類良好(圖1)。

圖1 差異表達(dá)最顯著的前30個(gè)基因熱圖Fig.1 Heatmap of first 30 genes with most significant differential expression

2.2DEGs的生物信息學(xué)分析 GO分析發(fā)現(xiàn)，DEGs主要參與細(xì)胞黏附、生物黏附、細(xì)胞或亞細(xì)胞運(yùn)動、細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞外基質(zhì)組織等生物學(xué)進(jìn)程，富集于細(xì)胞-基質(zhì)連接、焦點(diǎn)連接、細(xì)胞-基質(zhì)黏附、黏著連接、錨定連接等細(xì)胞組件，參與細(xì)胞黏附分子結(jié)合、肌動蛋白結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、激酶結(jié)合、細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合等。DEGs主要富集于黏附斑激酶通路、癌癥通路、磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)通路、Hippo信號通路及WNT信號通路、AMPK信號通路及PCa通路。上調(diào)DEGs可參與AMPK信號通路，下調(diào)DEGs可參與WNT信號通路(圖2、3)。

圖2 上調(diào)的DEGs參與AMPK信號通路Fig.2 Upregulated DEGs participate in AMPK signaling pathwayNote:Red.Upregulated DEGs；green.AMPK signaling pathway genes.

圖3 下調(diào)的DEGs參與WNT信號通路Fig.3 Involvement of down-regulated DEGs in WNT signaling pathwayNote:Red.Down-regulation of DEGs;green.WNT signaling pathway genes.

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.4 PPI networkNote: Each node represents associated protein or gene.

2.3DEGs的PPI分析 對DEGs進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析(圖4)，MCODE插件進(jìn)行模塊化分析，共篩選出顯著模塊3個(gè)(圖5)，MOCDE得分依次為8.417、6.000、4.667分，說明WNT6與FZD7為上下游關(guān)系。

圖5 PPI網(wǎng)絡(luò)中的3個(gè)重要模塊Fig.5 Three important modules in PPI networkNote: Each node represents associated protein and yellow represents the seed node.

2.4WNT6及FZD7在PCa和BPH組織的表達(dá) Western blot 結(jié)果顯示，PCa組織WNT6及FZD7含量明顯低于BPH組織(P<0.05，圖6)。免疫組化結(jié)果顯示，BPH組織中，WNT6蛋白的陽性表達(dá)率為92.5%(37/40)，PCa組織WNT6陽性表達(dá)率為37.5%(15/40)(P<0.01，圖7、8)。BHP組織中FZD7蛋白陽性表達(dá)率為47.5%(19/40)，PCa組織陽性率為20.0%(8/40)(P<0.05，表1)。WNT6與FZD7蛋白表達(dá)與PCa組織臨床病理參數(shù)的關(guān)系如表2所示， 術(shù)前血清PSA≥10 ng/ml組中WNT6與FZD7表達(dá)陽性率低于PSA<10 ng/ml組(P<0.05)；Gleason評分>7分組中WNT6、FZD7陽性表達(dá)率低于Gleason評分≤7分組(P<0.05)。PCa組織WNT6與FZD7陽性表達(dá)與年齡及腫瘤分期無關(guān)(P>0.05)。

圖6 BPH和PCa中WNT6及FZD7蛋白表達(dá)Fig.6 Expression of WNT6 and FZD7 in BPH and PCaNote:Compared with BPH group,*.P<0.05.

圖7 WNT6在BPH和PCa組織中的表達(dá)情況(×100)Fig.7 Expression of WNT6 in BPH and PCa (×100)Note:A.Expression of WNT6 in BPH;B.Expression of WNT6 in PCa.

圖8 FZD7在BPH和PCa組織中的表達(dá)情況(×100)Fig.8 Expression of FZD7 in BPH and PCa(×100)Note:A.Expression of FZD7 in BPH;B.Expression of FZD7 in PCa.

表1 WNT6及FZD7在BPH組織和PCa組織中的表達(dá)

表2 WNT6及FZD7與PCa病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

近年來，PCa的發(fā)病率及死亡率呈逐年上升的趨勢且發(fā)病年齡逐漸降低。PCa細(xì)胞的持續(xù)增殖和轉(zhuǎn)移是晚期PCa的重要臨床特征和主要死亡原因[8,9]。PCa與正常前列腺組織基因表達(dá)譜的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，DEGs主要集中于黏附斑激酶通路、癌癥通路、PI3K/AKT通路、Hippo信號通路、WNT信號通路、AMPK信號通路及PCa通路。其中，WNT信號通路是由配體蛋白質(zhì)WNT和膜蛋白受體FZD結(jié)合激發(fā)的多下游通道的高度保守信號通路，是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移和調(diào)亡的重要途徑，通過某些特定的基因調(diào)節(jié)，在胚胎發(fā)育、維持組織細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)等生理過程中發(fā)揮重要作用[10,11]。Wang等[12]確定WNT1作為WNT信號通路的一部分，在PCa細(xì)胞增殖、遷移和干細(xì)胞更新中起重要作用。另一項(xiàng)PCa組織的研究中，WNT5a作為非經(jīng)典WNT信號通路配體，與其受體FZD2共同作用可誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，與PCa的代謝改變、侵襲和復(fù)發(fā)聯(lián)系緊密[13]。而WNT6及其假定受體FZD7在PCa發(fā)生發(fā)展的作用尚未闡明，且國內(nèi)外尚無相關(guān)研究。本研究通過生物信息學(xué)技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)WNT6和FZD7是PCa中的下調(diào)基因，二者在PCa和BPH組織中均有表達(dá)，但在PCa組織中的表達(dá)明顯低于BPH組織(P<0.05)，提示W(wǎng)NT6及FZD7在PCa組織中呈低表達(dá)，與生物信息學(xué)分析結(jié)果一致，表明WNT6及FZD7的表達(dá)差異是區(qū)分PCa與BPH的重要標(biāo)志，二者可能在PCa發(fā)生發(fā)展中起抑癌作用。本研究還發(fā)現(xiàn)WNT6及FZD7的表達(dá)與血清PSA水平和Gleason評分相關(guān)，提示隨著PCa中WNT6及FZD7表達(dá)減少，PCa細(xì)胞異常增殖、分化，導(dǎo)致PCa預(yù)后較差。因此，通過提高WNT6及FZD7表達(dá)水平，可抑制PCa細(xì)胞生長、增殖及侵襲。

WNT信號通路傳導(dǎo)途徑復(fù)雜。研究發(fā)現(xiàn)，WNT家族中WNT3、WNT3a、WNT5a等在PCa細(xì)胞中高表達(dá)[14-16]。本研究通過基因芯片及Western blot發(fā)現(xiàn)，WNT6及FZD7在PCa中低表達(dá)，表明WNT家族的19種成員在PCa發(fā)生發(fā)展中的作用各不相同。WNT信號通路引起PCa發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制尚不明確，可能主要涉及以下幾點(diǎn)：①雄激素受體(androgen receptor，AR)。PCa是一種雄激素依賴性疾病，Lee等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在雄激素依賴性PCa細(xì)胞中，AR信號可抑制β-catenin/TCF介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，表明WNT信號可能在PCa進(jìn)展為去勢抵抗性PCa的過程中發(fā)揮重要的作用；②PCa干細(xì)胞。WNT信號通路在腫瘤干細(xì)胞中高度活躍，可能在PCa干細(xì)胞中起自我更新作用[18,19]。Wang等[20]通過基因譜研究表明，在成人PCa干細(xì)胞群中檢測到WNT靶基因lgr5的表達(dá)，且lgr5+干細(xì)胞具有導(dǎo)致PCa去勢抵抗的能力。

綜上所述，本研究通過生物信息學(xué)方法分析PCa及正常前列腺組織的基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)影響PCa發(fā)生發(fā)展的重要通路及關(guān)鍵基因，選取下調(diào)基因富集的WNT信號通路，通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)WNT6及假定受體FZD7在PCa中低表達(dá)，同時(shí)WNT6及FZD7與PCa的血清PSA水平、Gleason評分密切相關(guān)，而與患者的年齡及臨床分期無關(guān)，提示W(wǎng)NT6與FZD7很可能在PCa的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮抑癌作用。對PCa患者的WNT6與FZD7進(jìn)行干預(yù)，可能提高PCa治療效果。檢測PCa患者WNT6及FZD7表達(dá)有助于PCa危險(xiǎn)程度、治療效果和預(yù)后的判斷。WNT6與FZD7作為PCa的治療靶點(diǎn)不可忽視，其很可能在PCa發(fā)生發(fā)展中起抑癌作用，為闡述PCa的發(fā)病機(jī)制及診斷提供了全新視角，并為PCa靶向治療藥物的開發(fā)提供新方向。WNT信號通路與其他信號通路的聯(lián)系需進(jìn)一步研究，使PCa的基因研究更加透徹，深化對PCa發(fā)生發(fā)展的認(rèn)識，從而對其進(jìn)行更好地防治。