孫慶云，曹金鳳，杜元杰，周亮，朱序理，王躍，趙志明

(河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科，石家莊 050000)

據(jù)報道，我國不孕不育夫婦中約20%的不育癥是由單純男方原因引起，27%由男女雙方原因引起，總體男方因素所致不育約占50%[1]。近年來，卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)技術(shù)的成熟應(yīng)用給許多男性不育患者帶來希望。有學(xué)者認(rèn)為射精、經(jīng)皮附睪穿刺抽吸術(shù)(PESA)、經(jīng)皮睪丸精子抽吸術(shù)(TESA)等方式獲得的精子行ICSI可以獲得相似的臨床妊娠率[2-3]，但其最終妊娠結(jié)局的報道不一，且對于其嬰兒出生結(jié)局的報道較少。本研究回顧性分析本院生殖醫(yī)學(xué)中心3種不同來源精子行ICSI助孕的患者資料，旨在探討不同來源精子對ICSI周期活產(chǎn)率、出生缺陷發(fā)生情況等助孕結(jié)局的影響，以期更好地指導(dǎo)臨床工作。

一、資料與方法

1.研究對象及分組：回顧性分析2012年1月至2018年6月在本院生殖醫(yī)學(xué)中心行ICSI-ET助孕的2 527例患者(2 573個新鮮移植周期)的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)女方年齡≤38歲；(2)MⅡ卵數(shù)≥3枚；(3)助孕周期≤2個周期；(4)移植胚胎數(shù)2枚；(5)促排方案采用黃體中期長方案。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)女方因輸卵管積水、宮腔積液等因素造成的不孕；(2)夫婦一方或雙方染色體核型異常。

根據(jù)精子獲取方式不同分為：射精組，1 987 例(2 007個周期)；PESA組，353 例(373個周期)；TESA組，187例(193個周期)。

2.研究方法：控制性促排卵：采用黃體中期長方案促排，自促排前1個月經(jīng)周期的黃體中期開始，給予促性腺激素釋放激素激動劑(GnRH-a，達必佳，輝凌，瑞士)0.1 mg每日皮下注射，達到降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)后開始每日注射150～300 U促性腺激素(Gn)直至扳機日，當(dāng)卵泡發(fā)育達到至少有1個主導(dǎo)卵泡直徑≥18 mm或兩個主導(dǎo)卵泡直徑≥17 mm或3個主導(dǎo)卵泡直徑≥16 mm時，于該日21∶00肌肉注射HCG(珠海麗珠)5 000～10 000 U，HCG注射后36～38 h經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下取卵。

取卵日精子準(zhǔn)備：(1)射精組：患者禁欲3～5 d后手淫法取精，密度梯度離心法處理精液，極偶見精子的精液可使用直接洗滌法。(2)PESA組：囑患者排空膀胱，取仰臥位，常規(guī)消毒鋪孔巾，2%利多卡因精索阻滯麻醉，采用5 ml注射器連接4號針頭吸取1 ml培養(yǎng)液，經(jīng)皮行附睪穿刺，邊穿刺邊抽吸，在針頭端可見渾濁附睪液體抽出，將附睪液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中。在倒置顯微鏡下觀察是否有活動精子，如有則直接洗滌法處理附睪液備用；如鏡下未找到活動精子則重復(fù)穿刺另一側(cè)附睪，如穿刺失敗或仍無活動精子則改行TESA取精術(shù)。(3)TESA組：患者排空膀胱后取仰臥位，常規(guī)消毒鋪孔巾，2%利多卡因精索阻滯麻醉，采用20 ml注射器連接12號針頭(帶側(cè)孔)，經(jīng)皮行睪丸穿刺，將取到的睪丸組織注入含G-MOPs液(vitrolife，瑞士)的培養(yǎng)皿中，用兩只1 ml注射器針將組織分離撕碎，倒置顯微鏡下觀察是否有精子。有精子者將撕碎的組織混懸液離心，300g離心5 min，留沉渣置36℃培養(yǎng)箱內(nèi)備用；若鏡檢未找到精子者需要再次穿刺睪丸取精，如再次穿刺睪丸鏡檢仍未找到精子則經(jīng)患者夫婦知情同意后將卵子冷凍保存。

人工授精：取卵后卵冠丘復(fù)合物置于受精液中預(yù)培養(yǎng)1～2 h后拆去顆粒細胞，觀察卵母細胞成熟度并對成熟卵母細胞進行ICSI操作。

胚胎移植和黃體支持：胚胎培養(yǎng)3 d后擇優(yōu)移植，移植胚胎數(shù)均為2枚。移植后行常規(guī)黃體支持：肌肉注射黃體酮(浙江仙琚制藥)60 mg/d或8%黃體酮緩釋凝膠(雪諾同，默克，英國)陰道給藥1次/d。B超檢查見心管博動后逐漸減量至停止。

胚胎評估與冷凍：ICSI后16～18 h進行原核觀察，ICSI后40～42 h(D2)和64～66 h(D3)進行卵裂期胚胎觀察。根據(jù)胚胎形態(tài)特征對D3胚胎進行評分分級，胚胎評分標(biāo)準(zhǔn)按英國Bourn Hall Clinic評分法[4]進行，D3胚胎冷凍標(biāo)準(zhǔn)：移植后剩余的評分1、2級的胚胎進行玻璃化冷凍保存。

臨床妊娠的診斷標(biāo)準(zhǔn)：患者胚胎移植后14～15 d，檢查尿妊娠試驗陽性或血β-HCG≥10 U/L為HCG陽性；胚胎移植后28～30 d 超聲檢查可見孕囊及心管搏動者為臨床妊娠。

觀察指標(biāo)：記錄3組的臨床妊娠率(臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%)、胚胎種植率(種植胚胎數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%)、正常受精率(2PN率)(2PN數(shù)/MⅡ卵數(shù)×100%)、2PN卵裂率(2PN卵裂數(shù)/2PN數(shù)×100%)、可利用胚胎率(可利用胚胎數(shù)/2PN卵裂數(shù)×100%)、流產(chǎn)率(流產(chǎn)周期數(shù)/妊娠周期數(shù)×100%)、活產(chǎn)率(活產(chǎn)周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%)、出生胎兒男女比例以及出生缺陷率(出生缺陷胎兒數(shù)/出生胎兒總數(shù)×100%)。

二、結(jié)果

1.各組患者的一般資料比較：統(tǒng)計結(jié)果顯示，不同來源精子組的女方年齡、助孕周期數(shù)、不孕年限、獲卵數(shù)、MⅡ卵數(shù)比較均無顯著性差異(P>0.05)(表1)。

表1 三組患者一般資料比較(-±s)

2.各組患者的實驗室指標(biāo)比較：統(tǒng)計結(jié)果顯示，射精組的2PN率和可利用胚胎率顯著高于PESA和TESA組(P<0.01)；射精組、TESA組的2PN卵裂率顯著高于PESA組(P<0.01)(表2)。

表2 三組患者實驗室指標(biāo)比較(%)

3.各組患者的妊娠結(jié)局及新生兒情況比較：3組患者的臨床妊娠率和胚胎種植率比較無顯著性差異(P>0.05)；3組患者的多胎率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率、新生兒男女性別比及出生缺陷發(fā)生率比較均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 不同來源精子患者的妊娠結(jié)局(%)

三、討論

隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，ICSI技術(shù)在臨床成熟應(yīng)用，不同來源精子行ICSI均可獲得較好的妊娠結(jié)局，但不同來源精子對臨床結(jié)局的影響各學(xué)者報道不一，仍存在爭議。本研究主要對不同來源精子行ICSI的實驗室數(shù)據(jù)和臨床結(jié)局進行分析，樣本量較大，入組標(biāo)準(zhǔn)更嚴(yán)格，女方年齡≤38歲，患者促排方案均為黃體中期長方案，移植胚胎均為D3卵裂期胚胎，移植數(shù)均為2枚，各組患者一般資料具有可比性，更能客觀分析不同精子來源對妊娠結(jié)局的影響，且隨訪并統(tǒng)計了患者活產(chǎn)率、出生嬰兒性別比及出生嬰兒缺陷率等，為指導(dǎo)臨床工作提供了更全面的參考。

1.不同取精方式對實驗室指標(biāo)的影響：射精組、PESA組和TESA組的2PN率分別為83.28%、76.75%和76.33%，射精組最高，這可能與射精組精子活力、活率總體高于PESA組和TESA組有關(guān)，而附睪、睪丸穿刺獲得的精子量少、活力差、活率低，精子畸形率相對高，盡管行ICSI仍有部分精子不能有效激活卵子受精。有報道稱ICSI受精率與精子活力、活率有關(guān)[5]。本研究中射精組、PESA組和TESA組的2PN卵裂率分別為98.84%、97.85%和99.26%，PESA組顯著低于射精組和TESA組；這與之前部分學(xué)者的報道不同，可能與經(jīng)皮附睪穿刺獲得的精子DNA碎片率較高有關(guān)，尤其是在阻塞性無精子癥患者中，精子在附睪內(nèi)停留時間長，精子活動力下降，DNA斷裂增加，從而可以導(dǎo)致胚胎發(fā)育阻滯[4，6]。3組的可利用胚胎率分別為57.43%、53.59%和53.28%，PESA組雖然2PN卵裂率顯著低于TESA組，但兩組的可利用胚胎率相似，射精組可利用胚胎率最高，這可能與射精組2PN受精率高從而可以獲得更多的胚胎發(fā)育有關(guān)[2]。

2.不同取精方式對妊娠結(jié)局的影響：不同來源即射精、附睪、睪丸來源精子行ICSI的妊娠結(jié)局報道不一，部分學(xué)者報道TESA組受精率低、妊娠率低[7-9]，另外有學(xué)者則認(rèn)為PESA組和TESA組種植率和妊娠率較射精組高[10-11]。目前大部分研究集中于不同來源精子行ICSI后的胚胎實驗室指標(biāo)和早期臨床妊娠結(jié)局，包括我們前期開展的研究，由于樣本量小，研究結(jié)論認(rèn)為TESA組著床率、妊娠率有升高的趨勢[2]，但未對不同來源精子行ICSI后活產(chǎn)率進行分析。本研究結(jié)果與上述報道有所不同，本研究中射精組、PESA組和TESA組的臨床妊娠率、種植率、多胎率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率比較均無顯著性差異，提示不同來源精子行ICSI后可以獲得相似的活產(chǎn)率[3，12-13]，該結(jié)論對臨床有較重要的指導(dǎo)意義，提示在臨床工作中不應(yīng)單純認(rèn)為睪丸穿刺取精行ICSI的妊娠率高，在1次體外助孕失敗后直接行睪丸穿刺取精ICSI[14]；如果患者取精方便可以行射精來源ICSI，以避免不必要的睪丸手術(shù)和創(chuàng)傷以及遠期對男性激素分泌的可能影響[15-16]。對于反復(fù)種植失敗患者或者DNA碎片較高患者可以考慮睪丸穿刺取精行ICSI[17-19]，但應(yīng)嚴(yán)格把握睪丸穿刺適應(yīng)證。本研究3組患者的多胎率均較高，可能與患者年齡均≤38歲，胚胎質(zhì)量較好有關(guān)。目前我們在臨床工作中，已經(jīng)實行部分患者D3單胚胎移植或者囊胚培養(yǎng)后行單囊胚移植，以避免多胎妊娠。

3.不同取精方式對嬰兒出生性別比及出生缺陷發(fā)生率的影響：關(guān)于不同來源精子行ICSI后出生情況的報道較少，PESA、TESA精子與正常射精所得精子在精子形態(tài)、活力以及攜帶遺傳物質(zhì)等方面可能存在差異，但是否導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常繼而增加子代出生缺陷發(fā)生的風(fēng)險尚不明確。有報道稱在重度少弱精子癥患者中，睪丸和附睪來源精子、睪丸和供精來源精子行ICSI后，其圍產(chǎn)結(jié)局及新生兒參數(shù)沒有顯著差異[20-21]。Guo等[22]也報道與射精組相比，PESA、TESA組行ICSI并不增加死胎及胎兒畸形的幾率，雖然沒有顯著性差異，但TESA組的胎兒畸形率有輕微上升的趨勢。本研究中射精組、PESA組和TESA組的出生性別比及出生缺陷率比較無顯著性差異，提示不同來源精子行ICSI后并未增加嬰兒性別差異及子代出生缺陷發(fā)生風(fēng)險，不同來源的精子均能獲得較好的妊娠結(jié)局。

綜上所述，對于男性不育患者，不同來源精子行ICSI助孕雖然2PN率、2PN卵裂率和可利用胚胎率不同，但最終均能獲得較好的活產(chǎn)率及相似的妊娠結(jié)局，且未明顯增加嬰兒出生性別差異及子代出生缺陷；提示如射精可以獲得精子時可以優(yōu)先考慮射精取精，而非優(yōu)選附睪或睪丸穿刺取精。