張釧，周秉博，張慶華，王興，郝勝菊，陳雪，李富萍，劉亞利，劉青，馬旭，曹宗富*

(1.國家衛(wèi)生健康委科學技術(shù)研究所，北京 100081；2.北京協(xié)和醫(yī)學院研究生院，北京 100730；3. 甘肅省婦幼保健院醫(yī)學遺傳學中心，蘭州 730050)

耳聾是人類最常見的感覺缺陷之一，耳聾在新生兒中的發(fā)病率約為1/1 000[1-2]。約有50%～60%的耳聾是由遺傳因素引起的[3]。耳聾的遺傳方式有常染色體隱性遺傳、常染色體顯性遺傳、線粒體遺傳及X/Y連鎖遺傳。目前已經(jīng)有超過110多個基因被報道與耳聾相關(guān)[4]。流行病學研究表明GJB2、SLC26A4和12SrRNA是遺傳性耳聾最常見的致病基因[2]。耳聾的遺傳學診斷非常重要，它可以為患者家庭提供治療決策、預(yù)后信息和遺傳咨詢。本研究采用耳聾基因芯片、Sanger測序法及高通量測序Pannel法，對在甘肅省婦幼保健院遺傳中心就診的354個耳聾高危兒及39個耳聾患者家系進行耳聾基因診斷分析，并為這些家庭提供遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷。

資料與方法

一、研究對象

收集2015年5月至2019年12月在甘肅省婦幼保健院遺傳中心就診的354例漢族耳聾高危兒患者及39例漢族耳聾患者家系的臨床資料。本研究經(jīng)甘肅省婦幼保健院倫理委員會批準[2016院倫審研第(4)號]，血樣的采集及臨床資料的收集征得所有家系成員的同意，并簽署知情同意書。

二、基因組DNA提取

采集耳聾高危兒足跟血干血斑，其父母抽取外周血2～3 ml；耳聾患者及其父母抽取外周血2～3 ml。干血斑及外周血基因組DNA分別按照干血斑基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)與血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)的說明書進行。耳聾患者家庭的先證者母親再孕時，于孕18～21周經(jīng)腹行羊膜腔穿刺，抽取羊水15 ml。按羊水細胞基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)說明書進行模板DNA的提取，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

三、耳聾基因芯片檢測

使用晶芯十五項遺傳性耳聾相關(guān)基因檢測試劑盒(北京博奧晶典)檢測GJB2基因c.35delG、c.176_191del16、c.235delC及c.299_300delAT 4個位點；GJB3基因c.538C>T 1個位點；SLC26A4基因c.2168A>G、IVS7-2A>G、c.1174A>T、c.1226G>A、c.1229C>T、c.1975G>C、c.2027T>A及IVS15+5G>A 8個位點；線粒體12SrRNA基因chrM-1494C>T及chrM-1555A>G 2個位點。PCR擴增條件：37℃ 10 min，95℃ 15 min，95℃ 30 s，57℃ 30 s，70℃ 45 s，35 cycles；60℃ 10 min，12℃暫停。芯片雜交：50℃水浴1 h。掃描判讀：結(jié)果由晶芯十五項遺傳性耳聾相關(guān)基因檢測分析系統(tǒng)自動判讀。當探針的檢測信號值大于或等于該探針位點的cut off值時，判斷該探針為陽性；當探針的檢測信號值小于該探針的cut off值時，判斷該探針為陰性。

四、GJB2及12S rRNA基因突變分析

基因外顯子擴增引物由上海生工公司合成。PCR擴增體系為25 μl：其中2×Taq PCR Mastermix(北京天根生化科技有限公司)12.5 μl，基因組DNA模版1.5 μl(濃度20～50 ng/μl)，上下游引物(10 μmol/L)各 0.5 μl，ddH2O 10 μl。PCR引物及擴增條件見表1，由于GJB2擴增產(chǎn)物較長，除了正反向測序外，同時使用兩條測序引物進行測序反應(yīng)，兩條測序引物(5’-3’)分別為：TGGGTTTTGATCTC-CTCGATG，GCCTACCGGAGACATGAGAAG。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂電泳鑒定后對目的條帶單一的產(chǎn)物采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(北京天根生化科技有限公司)純化后，由ABI 3500型(ABI，美國)測序儀進行測序，測序結(jié)果使用SeqMan軟件與標準序列進行比對分析，鑒定GJB2及12SrRNA是否存在突變。

表1 引物序列、產(chǎn)物大小及擴增條件

五、高通量測序Pannel分析

耳聾患者經(jīng)GJB2及12SrRNA基因突變分析后，仍未明確突變者，采用高通量測序Pannel法(北京邁基諾基因科技股份有限公司)進行耳聾相關(guān)基因檢測以明確致病突變，測序平均深度為200×，大于20×的靶向reads達到97%以上。

六、數(shù)據(jù)分析

高通量測序得到的結(jié)果與參考基因組(GRCh37/hg19)比對得到所有變異的文件，對檢測到的堿基變異進行篩選，應(yīng)用PolyPhen2(http：∥genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)和 MutationTaster(http：∥www.mutationtaster.org/)軟件對新變異進行蛋白功能預(yù)測，新變異致病性判讀依據(jù)美國醫(yī)學遺傳學與基因組學會2015指南[5]。計數(shù)資料以率(%)表示。

結(jié) 果

一、耳聾高危兒基因芯片檢測

晶芯十五項基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)，354例漢族耳聾高危兒中，316例高危兒未檢測到突變，有21例檢測到了GJB2基因突變，其中17例高危兒檢測到GJB2雜合突變，2例高危兒檢測到GJB2復(fù)合雜合突變，2例高危兒檢測到GJB2純合突變；有16例患者檢測到了SLC26A4突變，其中11例高危兒檢測到SLC26A4雜合突變，1例高危兒檢測到SLC26A4復(fù)合雜合突變，4例高危兒檢測到SLC26A4純合突變；1例患者檢測到12SrRNA均質(zhì)突變。

GJB2突變中，突變頻率最高的位點是c.235delC，其次為c.299_300delAT；SLC26A4突變中，突變頻率最高的位點是c.919-2A>G(IVS7-2A>G)，其次為c.1174A>T與c.2168A>G(表2)。

二、耳聾患者Sanger測序和高通量Pannel測序

Sanger測序及高通量Pannel測序發(fā)現(xiàn)，39例漢族耳聾患者中，有13例檢測到了GJB2基因突變，其中9例檢測到復(fù)合雜合突變，2例檢測到純合突變，2例僅檢測到雜合突變；有15例患者檢測到了SLC26A4突變，其中8例檢測到復(fù)合雜合突變，5例檢測到純合突變，2例檢測到雜合突變；10例患者檢測到12SrRNA均質(zhì)突變；1例患者檢測到LOXHD1復(fù)合雜合突變。

GJB2突變中，突變頻率最高的位點是c.235delC，其次為c.299_300delAT及c.109G>A；SLC26A4突變中，突變頻率最高的位點是c.919-2A>G(IVS7-2A>G)，其次為c.1174A>T、c.2162C>T、c.410C>T和IVS15+5G>A(表2)。

表2 耳聾高危兒及耳聾患者耳聾基因致病位點分布

三、耳聾患者家系產(chǎn)前診斷分析結(jié)果

39例漢族耳聾患者家系中，有6例先證者明確診斷的家系在再次妊娠時進行了遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷。6例胎兒中，有3例檢測到了與先證者相同的致病突變，2例胎兒僅檢測到1個致病突變，1例胎兒未檢測到與先證者相同的致病突變(表3)。

表3 耳聾家系產(chǎn)前診斷結(jié)果

討 論

遺傳性耳聾的致病基因受遺傳背景影響，在不同地區(qū)、不同人種中耳聾致病基因及其突變頻率存在明顯的差異；在中國，GJB2、GJB3、SLC26A4及12SrRNA是遺傳性耳聾的主要致病基因[6]。在本研究的39例漢族耳聾患者中，GJB2突變檢出率為33.3%、SLC26A4突變檢出率為38.5%、12SrRNA突變檢出率為25.6%，高于國內(nèi)新疆和福建地區(qū)報道的耳聾患者這三個基因的攜帶頻率[7-8]。在本研究中，GJB2(c.235delC)位點及SLC26A4(c.919-2A>G)是最主要的突變位點，這與多個地區(qū)的文獻報道[6，9-11]相一致。

我國已經(jīng)普及了新生兒的聽力篩查，有效降低了出生缺陷，但由于超過50%～60%的耳聾是由遺傳因素造成，僅進行聽力篩查不僅無法明確病因還會漏掉遲發(fā)性耳聾的檢出。本研究中，354例耳聾高危兒中有38例(10.7%)檢測到了耳聾基因突變，其中9例(2.54%)確診為耳聾患者，1例為母系遺傳藥物性耳聾的易感個體。目前，國內(nèi)多個省份地區(qū)已經(jīng)開展了聽力篩查+耳聾基因篩查的模式，有效提升新生兒異常檢出率，可以更好地進行耳聾防治干預(yù)[12-14]。對新生兒進行耳聾基因篩查能及早發(fā)現(xiàn)母系遺傳藥物性耳聾的易感個體，通過用藥指導(dǎo)可有效避免因藥物導(dǎo)致的耳聾[15]。然而，目前國內(nèi)新生兒的耳聾基因篩查只是在一些發(fā)達省份及地區(qū)普遍開展，在經(jīng)濟欠發(fā)達的西部省份還有待進一步推行新生兒耳聾基因篩查。

多種方法可以進行遺傳性耳聾的基因診斷，包括基因芯片法、Sanger測序法、高通量測序Pannel法及全外顯子組測序法等。臨床上主要使用的是基因芯片法、Sanger測序法和高通量測序Pannel法。目前新生兒耳聾基因篩查主要使用的是耳聾基因芯片法，該方法雖然涵蓋了GJB2、GJB3、SLC26A4及12SrRNA這4個耳聾基因，但是僅包含了少量的熱點突變。近年來，高通量測序Pannel法和全外顯子組測序法逐漸成為遺傳性耳聾基因診斷的重要工具，可以發(fā)現(xiàn)一些罕見性的耳聾致病突變基因。

對新生兒進行耳聾基因篩查是預(yù)防耳聾的三級措施，對于生育過耳聾患者的家庭來說，明確致病基因及位點后，孕期進行產(chǎn)前診斷可以明確胎兒的基因型，從而有效避免患病胎兒的出生[16-17]。本研究對在甘肅省婦幼保健院診斷的39個耳聾患者家庭中的6個家庭進行了產(chǎn)前診斷，明確了胎兒的基因型，為這些家庭進行了生育指導(dǎo)。

本研究通過對354例耳聾高危兒進行耳聾基因檢測，說明在新生兒中進行耳聾篩查+耳聾基因篩查的模式可以提高異常致病耳聾基因檢出率，盡早地進行耳聾防治干預(yù)。高通量測序法可以提高耳聾致病基因的檢出率，并且可以發(fā)現(xiàn)罕見的耳聾致病突變基因。通過對耳聾患者家系先證者進行耳聾基因產(chǎn)前診斷，可為這些家庭提供遺傳咨詢并進行生育指導(dǎo)，可以有效降低這些家庭的經(jīng)濟負擔。