阮建佳，杜 巖

(1. 天津市薊州區(qū)人民醫(yī)院綜合內(nèi)科，2. 天津市薊州區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，天津 301900)

肝纖維化[1]是肝臟受到損傷后自我修復(fù)過(guò)程的代償反應(yīng)，其中肝星狀細(xì)胞的活化增殖與肝纖維化密切相關(guān)，正常肝臟中肝星狀細(xì)胞呈靜息的狀態(tài)，當(dāng)受到損傷后，便出現(xiàn)活化增殖，轉(zhuǎn)變成肌成纖維細(xì)胞，細(xì)胞外基質(zhì)增多，促使肝纖維化形成，故而治療肝纖維化的重點(diǎn)在于阻礙肝星狀細(xì)胞增殖以及加速其凋亡。青蒿琥酯是青蒿素的水溶性衍生物，具有抗病毒、調(diào)節(jié)免疫、解毒保肝等藥理作用，青蒿琥酯(artesunate, Art)具有抗肝纖維化作用，能降低羥脯氨酸(hydroxyproline, Hyp)的含量，應(yīng)用青蒿琥酯后肝星狀細(xì)胞中神經(jīng)酰胺(ceramide, Cer)的水平發(fā)生變化，神經(jīng)酰胺[2-4]為神經(jīng)鞘脂類(lèi)，與細(xì)胞的分化、增殖、凋亡活動(dòng)密切相關(guān)，神經(jīng)酰胺合酶為神經(jīng)酰胺合成中的關(guān)鍵酶，選用神經(jīng)酰胺合酶阻斷劑伏馬菌素B1(fumonisin B1, FB1)來(lái)阻斷神經(jīng)酰胺合酶的合成，進(jìn)而探討青蒿琥酯抑制肝纖維化過(guò)程中神經(jīng)酰胺合酶-神經(jīng)酰胺通路的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

人源肝星狀細(xì)胞株 LX-2由天津醫(yī)科大學(xué)提供。

1.2 主要試劑及儀器

青蒿琥酯由桂林南藥有限公司提供；神經(jīng)酰胺購(gòu)自Sigma公司；Fumonisin B1購(gòu)自Sigma公司；Caspase-3抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；神經(jīng)酰胺合酶2(homo sapiens longevity assurance homologue 2, LASS2)抗體購(gòu)自SANTA CRUZ公司；羥脯氨酸測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成試劑公司；過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptors-γ, PPAR-γ) 購(gòu)自Santa cruz公司； DYCZ-40D型轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自北京市六一儀器廠(chǎng)；B600型低速自動(dòng)平衡離心機(jī)購(gòu)自河北省安新縣白洋離心機(jī)廠(chǎng)；HZS-H型水浴振蕩器購(gòu)自哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)分組

將LX-2細(xì)胞放置在37℃飽和濕度，5 %CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱里進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至約80%融合時(shí)，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS沖洗3次，再加入0.25%胰蛋白酶1 ml消化1 min，然后進(jìn)行細(xì)胞傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為四組：(1)Control組：細(xì)胞用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，不進(jìn)行任何處理；(2)Art處理組：細(xì)胞用Art 350 μmol/L處理24 h；(3)FB1處理組：細(xì)胞用FB1 6 μmol/L處理24 h；(4)Art 與FB1聯(lián)合處理組：細(xì)胞用Art 350 μmol/L+FB1 6 μmol/L處理24 h。各組均設(shè)計(jì)7個(gè)復(fù)孔，作用24 h結(jié)束后，收集LX-2細(xì)胞及細(xì)胞上清液進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 Western blot檢測(cè)LASS2、PPAR-γ 及Caspase-3蛋白的表達(dá)

將LX-2細(xì)胞接種于6孔板中，按上述實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行處理，提取細(xì)胞蛋白，用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白的濃度。取35 μg上樣，30%聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h后，全濕式電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜，分別加入LASS2(1∶500)、PPAR-γ(1∶500)及Caspase-3(1∶1 000)抗體于4℃孵育一夜，TBST洗膜3次，室溫下孵育二抗2 h，TBST洗膜3次，ECL發(fā)光液顯色之后曝光。采用Quantity One軟件進(jìn)行條帶灰度值分析。

1.5 HPLC-FLD法測(cè)定神經(jīng)酰胺的含量

將LX-2細(xì)胞接種于96孔板中，各組根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行處理，作用24 h后，收取上清液100 μl，加入等量的乙腈，13 000 r·min-1離心3 min。吸取上清液儲(chǔ)存于4℃冰箱中，檢測(cè)方法參考文獻(xiàn)[5](測(cè)定生物樣本中神經(jīng)酰胺含量的HPLC-FLD法)。

1.6 MTT法檢測(cè)LX-2的增殖情況

將LX-2細(xì)胞接種于96孔板中，各組根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行處理，作用24 h后，每孔加入MTT 10 μl，作用4 h后，棄凈培養(yǎng)基并吸干，每孔加入二甲基亞砜200 μl，置于酶標(biāo)儀中570 nm測(cè)定各孔吸光度值(A值)，按以下公式計(jì)算細(xì)胞抑制率(Inhibition Rate，IR)，抑制率(%)=[(對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值]×100%。

1.7 測(cè)定羥脯氨酸含量

將LX-2細(xì)胞接種于96孔板中，各組根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行處理，作用24 h后，留取細(xì)胞上清液，按照羥脯氨酸測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。計(jì)算公式：羥脯氨酸濃度(μg/ml)=(測(cè)定管吸光度-空白管吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(5 μg/ml)×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 Art對(duì)LX-2細(xì)胞LASS2蛋白表達(dá)的影響

與細(xì)胞對(duì)照組比較，Art可以增加LX-2細(xì)胞LASS2的表達(dá)，F(xiàn)B1可減少LX-2細(xì)胞LASS2的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Art單用組比較，F(xiàn)B1與Art合用組LX-2細(xì)胞的LASS2的表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.2 Art對(duì)LX-2細(xì)胞PPAR-γ、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

與細(xì)胞對(duì)照組比較，Art可顯著增加LX-2細(xì)胞PPAR-γ、Caspase-3蛋白的表達(dá)，F(xiàn)B1處理組，LX-2細(xì)胞PPAR-γ、Caspase-3蛋白表達(dá)減少，具有顯著性差異(P<0.05)。與Art單用組比較，F(xiàn)B1減弱Art對(duì)LX-2細(xì)胞PPAR-γ、Caspase-3蛋白表達(dá)升高的作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.3 Art對(duì)LX-2細(xì)胞分泌神經(jīng)酰胺的影響

與細(xì)胞對(duì)照組比較，Art可以增加LX-2細(xì)胞神經(jīng)酰胺的分泌，F(xiàn)B1可減少LX-2細(xì)胞神經(jīng)酰胺的分泌，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Art單用組比較，F(xiàn)B1與Art合用組LX-2細(xì)胞的神經(jīng)酰胺的分泌顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

2.4 Art和FB1對(duì)LX-2細(xì)胞增殖的影響

MTT結(jié)果顯示：與細(xì)胞對(duì)照組比較，Art對(duì)LX-2細(xì)胞的增殖有顯著的抑制作用，F(xiàn)B1可促進(jìn)LX-2細(xì)胞的增殖，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Art單用組比較，F(xiàn)B1與Art合用組，可降低Art對(duì)LX-2細(xì)胞的增殖抑制作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05，表2)。

2.5 Art和FB1對(duì)LX-2細(xì)胞羥脯氨酸水平的影響

與細(xì)胞對(duì)照組比較，Art可降低LX-2細(xì)胞羥脯氨酸的分泌，F(xiàn)B1增加LX-2細(xì)胞羥脯氨酸的分泌，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與Art單用組比較，F(xiàn)B1與Art合用可以減弱Art對(duì)LX-2細(xì)胞羥脯氨酸分泌的抑制作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05，表2)

3 討論

肝星狀細(xì)胞的增殖與活化是肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，抑制其增殖，促進(jìn)其凋亡是我們研究的重點(diǎn)，前期實(shí)驗(yàn)青蒿琥酯作用于肝星狀細(xì)胞后，其增殖受到抑制，并在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)應(yīng)用青蒿琥酯后神經(jīng)酰胺的水平發(fā)生變化[6]。青蒿琥酯如何調(diào)控神經(jīng)酰胺的水平進(jìn)而發(fā)揮抗肝纖維化的作用成為研究的關(guān)鍵。神經(jīng)酰胺[7]，是細(xì)胞膜中神經(jīng)鞘磷脂經(jīng)水解產(chǎn)生的脂質(zhì)分子，可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、凋亡等活動(dòng)，調(diào)控神經(jīng)酰胺的關(guān)鍵酶是：(1)酸性、中性、堿性鞘磷脂酶，可通過(guò)參與鞘磷脂水解過(guò)程產(chǎn)生神經(jīng)酰胺；(2)絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(serine palmitoyl transferase, SPT)是神經(jīng)酰胺從頭合成途徑的關(guān)鍵酶；(3)神經(jīng)酰胺酶可參與神經(jīng)酰胺向鞘氨醇的轉(zhuǎn)化；(4)神經(jīng)酰胺合酶[8]可促進(jìn)鞘氨醇向神經(jīng)酰胺的轉(zhuǎn)化。在哺乳動(dòng)物中神經(jīng)酰胺合酶存在六種類(lèi)型，LASS1-6，其中LASS2對(duì)神經(jīng)酰胺的合成最為重要，且在肝臟中含量很高，故本實(shí)驗(yàn)選用LASS2為神經(jīng)酰胺合酶的研究對(duì)象，選用神經(jīng)酰胺合酶抑制劑Fumonisin B1[9]來(lái)阻斷神經(jīng)酰胺合酶研究青蒿琥酯抑制肝纖維化中神經(jīng)酰胺合酶-神經(jīng)酰胺信號(hào)通路對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖及凋亡的影響。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示應(yīng)用神經(jīng)酰胺合酶阻斷劑FB1后，與細(xì)胞對(duì)照組比較，LX-2細(xì)胞的神經(jīng)酰胺合酶LASS2的表達(dá)減少并且神經(jīng)酰胺水平下調(diào)，青蒿琥酯可提高LX-2細(xì)胞LASS2的表達(dá)并提高神經(jīng)酰胺水平，且FB1與Art合用，發(fā)現(xiàn)FB1可以減弱Art對(duì)LX-2細(xì)胞LASS2蛋白表達(dá)及神經(jīng)酰胺水平升高的作用，證實(shí)Art發(fā)揮抗肝纖維化的作用與神經(jīng)酰胺合酶-神經(jīng)酰胺通路有關(guān)，揭示Art可能是通過(guò)調(diào)控神經(jīng)酰胺合酶蛋白表達(dá)，進(jìn)而影響LX-2細(xì)胞的增殖及凋亡。

PPAR-γ屬核受體家族成員，正常肝臟的肝星狀細(xì)胞中PPAR-γ表達(dá)增加，當(dāng)受到損傷或發(fā)生炎癥時(shí)，隨著肝星狀細(xì)胞的持續(xù)活化，PPAR-γ的表達(dá)逐漸減弱[10-11]，PPAR-γ對(duì)抑制肝星狀細(xì)胞的增殖活化有調(diào)節(jié)作用。并有研究證實(shí)神經(jīng)酰胺可促進(jìn)PPAR-γ的表達(dá)，進(jìn)而減少肝臟脂肪病變[12]。神經(jīng)酰胺能夠增加肝癌細(xì)胞PPAR-γ的轉(zhuǎn)錄活性，細(xì)胞周期阻滯，抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)[13]。本實(shí)驗(yàn)旨在研究肝纖維化中神經(jīng)酰胺對(duì)于肝星狀細(xì)胞增殖及凋亡的調(diào)控，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Art可顯著增加LX-2細(xì)胞PPAR-γ、Caspase-3的蛋白表達(dá)，F(xiàn)B1與Art合用組與Art單用組比較，LX-2細(xì)胞PPAR-γ、Caspase-3的表達(dá)上調(diào)作用明顯減弱，驗(yàn)證Art可通過(guò)神經(jīng)酰胺合酶-神經(jīng)酰胺通路上調(diào)PPAR-γ及Caspase-3蛋白的表達(dá)，抑制LX-2細(xì)胞的增殖并促進(jìn)其凋亡。

Tab. 1 Effects of Art and FB1 on the expressions of LASS2, PPAR-γ and Caspase-3 protein n = 7)

Tab. 2 Effects of Art and FB1 on the concentration of ceramide, the inhibition rate of LX-2 and the level of hydroxyproline n = 7)